Hi-Tech  ->  Программы  | Автор: | Добавлено: 2015-03-23

Консервативные участки цитохрома С

Цитохромы - это гемопротеины (железосодержащие белки), осуществляющие перенос электронов, окрашенные в красный или коричневый цвет. Действуя в определенной последовательности, они переносят электроны от убихинона на молекулярный кислород. Цитохромы содержат железо, входящее в состав железопорфириновой группы, или гема, напоминающего по своему строению простетическую группу гемоглобина. Цитохромы были открыты давно (сначала их назвали гистогематинами), но только в 1925 г. Дэвид Кейлин установил, что функция этих соединений связана с биологическим окислением. В летательных мышцах живых насекомых он обнаружил при помощи спектроскопа красно-коричневые пигменты. Оказалось, что спектр этих пигментов заметно менялся, когда насекомое, прикрепленное к предметному стеклу, делало резкие движения, пытаясь вырваться на свободу. Кейлин назвал эти пигменты цитохромами и высказал предположение, что они переносят электроны от пищевых веществ на кислород, претерпевая при этом окисление-восстановление. Существует три класса цитохромов: A, B и C, различающихся по спектрам поглощения. У каждого цитохрома в восстановленной (закисной) форме обнаруживаются три четкие полосы поглощения в видимой части спектра. Кейлин показал, что цитохромы действуют в определенной последовательности и что цитохром, стоящий последним в этом ряду, передает электроны на кислород.

Цитохромы в дыхательной цепи расположены в последовательности В -» С, -»С -»АА3. Цитохром B, присутствующий в двух формах, принимает электроны от убихинона и передает их цитохрому A, который в свою очередь передает их цитохрому с. Каждый из этих цитохромов, находясь в окисной [Fe(III)] форме, присоединяет один электрон и переходит в закисную [Fe(II)] форму. В переносе электронов от убихинона на цитохром С принимает участие также белок, содержащий железо и серу. Последним в ряду переносчиков электронов стоит цитохром аа3, называемый также цитохромоксидазой, поскольку он переносит электроны прямо на кислород и тем самым завершает процесс переноса.

Цитохром С - это небольшой белок (мол. масса 12500) с железопорфириновой группой, ковалентно присоединенной к единственной полипептидной цепи. Установлена аминокислотная последовательность белка и выяснены все детали трехмерной структуры его молекул. Цитохром C, легко экстрагируемый из митохондрий, был получен в кристаллической форме из многих источников. Цитохром C-один из белков, возникших на заре эволюции. На это указывает сходство многих участков его аминокислотной последовательности у всех эукариот: микроорганизмов, растений и животных.

Одним из наиболее интересных моментов функционирования цитохрома С является выяснение роли белковой глобулы в выполняемых им биологических функциях. Этот вопрос в настоящее время является предметом интенсивного научного поиска, так как он связан с такими фундаментальными научными проблемами как изучение механизма работы дыхательных цепей, митохондрий, фотосинтез. В настоящее время этот момент изучается множеством методов: электронная микроскопия, спектроскопия и др. Мы избрали для изучения данного вопроса методику биоинформатики. Биоинформатика - сравнительно молодая отрасль биологии, спецификой которой является использование вычислительных средств, методов и теорий для решения биологических вопросов. В нашем случае мы использовали различные методы сравнения структур цитохрома С различных организмов. Преимуществом этого подхода является то, что он позволяет выяснить наиболее общие закономерности построения и функционирования белковой глобулы цитохромов различных организмов.

Благодаря прогрессу в области биохимии и молекулярной биологии, к настоящему времени определено порядка сотни тысяч нуклеотидных последовательностей различных генов и первичных структур различных белков. Но всего для нескольких тысяч из них определены их пространственные структуры, поскольку методы определения пространственных структур макромолекул (ядерный магнитный резонанс, рентгеноструктурный анализ) гораздо сложнее, чем методы определения первичных структур нуклеиновых кислот и белков. Эти последовательности хранятся в электронных банках данных (например, GenBank – нуклеотидные последовательности; SwissProt – пространственные структуры белков), снабженных специальным интерфейсом для доступа к ним, благодаря чему они доступны для ученых всего мира через сеть «Интернет».

Благодаря такому большому массиву информации, банки данных позволяют не только идентифицировать неизвестные последовательности, но и выявлять закономерности строения различных белков. Например, можно установить, насколько белки гомологичны (родственны) друг-другу и т. п.

Однако для выявления и изучения закономерностей в структуре такого большого количества белков, и выявления биологического смысла этих закономерностей, необходимы специальные алгоритмы, которые реализуются специальными компьютерными программами. Разработано множество программ, ищущих гомологии; с ними можно работать по Интернету. Наиболее популярные - BLAST. Все они строят выравнивание (alignment) последовательностей, добиваясь наибольшего сходства между ними. При этом за повышение сходства часто приходится платить «разрывом» последовательностей . Потом программа оценивает сходство выровненных последовательностей и сообщает: гомологичны ли они (т. е. связаны ли они генетическим родством), и как выглядит наилучшее выравнивание их последовательностей.

Разные программы по-разному оценивают, чего стоит совпадение остатков, чего - сходство, чего - несовпадение, чего - начало разрыва, чего - дополнительный остаток в разрыве. В разных программах «штраф» за разрыв последовательности приводит к тому, что BLAST – одна из надёжных и общепринятых программ. BLAST оценивает родство по счёту (score) и Е-критерию (E-value). Существует также специальная формула перехода от score к E-value. К сожалению, как уже было сказано, все эти пороги не вполне одинаковы у разных программ (и у разных режимов их работы) , а к программе они, эти характеризующие «порог доверия» цифры, обычно не прилагаются (кроме программ типа BLAST, где приводится оценка статистической достоверности полученного сходства; правду, все эти цифры. есть в исходных статьях).

Больше всего все эти оценки достоверности и недостоверности найденного сходства «плавают» от программы к программе из-за того, что разные авторы по-разному оценивают «штраф» за разрыв последовательности. Если штраф столь высок, что запрещает все разрывы, то случайно выбранные 20-буквенные (белковые) последовательности сходны на уровне всего 5%. Если же этот штраф положить нулевым, то есть позволить делать любые разрывы «бесплатно», то случайно выбранные белковые (и вообще 20-буквенные) последовательности дают сходство на уровне 30-35% (а ДНКовые и РНКовые, 4-буквенные — на уровне 65%)! По мнению некоторых авторов (Финкельштейн) показывает, что оптимальное отделение «похожих» от «непохожих» белковых последовательностей достигается, когда начало разрыва последовательности штрафуется в цену двух или трех дополнительных совпадений аминокислотных остатков, а за удлинение разрыва платится примерно 1/20 — 1/100 этой цены за каждый дополнительный остаток в разрыве.

Можно ли распознать гомологичность, родственность последовательностей, если их сходство лежит ниже уровня в 30%, — т. е. в «сумеречной зоне» или даже ниже ее? Можно, но для этого надо работать со многими последовательностями. Именно работой со многими последовательностями отличаются «наиболее продвинутые» программы PSI-BLAST и НММеr от «простого» BLAST'a, работающего с отдельными последовательностями.

Для опознания гомологии «новых» последовательностей также удобно пользоваться «консенсусными последовательностями», выведенными для уже изученных белковых семейств и подчеркивающими их наиболее консервативные черты (если такие консенсусные последовательности снабжены данными по частотам встречаемости остатков в каждом месте цепи, то они называются «профилями первичных структур» семейств белков).

При опознавании функционального сходства белков следует также обращать внимание на уже установленные для многих функций «сайты» — более или менее короткие последовательности, обеспечивающие эти. Такие сайты собраны в библиотеки, и их поиском занимаются специальные программы, из которых PROSITE является наиболее популярной.

При установлении структуры «нового» белка по его гомологии с уже изученным надо ясно отдавать себе отчет, что сходство пространственных структур может не распространяться на районы, где последовательности сильно разошлись. В основном это районы петель, нерегулярных конформаций белковой цепи. Здесь, с весьма переменным пока успехом, приходится прибегать к конфирмационным расчетам и другим методам гомологического моделирования, на которых мы останавливаться не будем.

Кроме того, по мнению некоторых авторов даже полная идентичность фрагментов аминокислотных последовательностей не всегда гарантирует одинаковость их пространственных структур. Так, иногда одни и те же последовательности даже из 6-10 остатков входят в альфа-спираль в одних белках, и в бета-структуру — в других.

Таким образом, применение методов биоинформатики требует определенных навыков, а также знаний не только из области математической статистики, но и таких фундаментальных областей биологии, как молекулярная биология, генетика, биохимия.

Материалы и методы

Базы данных. В качестве базы данных для поиска нуклеотидных последовательностей был использован Genbank (США)

Выравнивание первичных структур. Для выравнивания первичных структур использовали программу Utopia («The Advanced Interfaces Group» ,Англия).

Сравнение пространственных структур. Для сравнения пространственных структур использовали программу Cn3D («National institute of health», США)

Результаты

Поиск гомологии в первичной структуре. С использованием программы Utopia был произведен поиск гомологичных цитохрому С человека белков с использованием алгоритма «BLAST». Было отобрано 100 первичных аминокислотных последовательностей цитохрома С, выделенных из разных организмов. Видно, что аминокислотные последовательности гомологичны, причем четко видны два участка, консервативные среди всех 100 аминокислотных последовательностей: QCHTV и NPKKYIPGTKMF. В пространственной структуре эти мотивы соответствуют участкам белка, прилегающим к простетической группе – гему с двух разных сторон.

Поиск гомологии в пространственной структуре. С использованием программы CN3D был произведен поиск гомологии в пространственной структуре с использованием алгоритма «VAST». Видно, что цитохром С из различных организмов сохраняет гомологию и в пространственной структуре, причем область, укладка которой практически идентична у всех изученных цитохромов С существенно больше, чем в первичной структуре. Эта область окружаюет гем.

Обсуждение результатов

Вышеприведенные результаты показывают, что структуры, как первичные, так и пространственные, цитохромов С из различных организмов, высокогомологичны. Вероятно, это обусловлено тем, что подобный мотив структуры совершенно необходим для выполнения цитохромом своих функций. Столь высокая гомология цитохромов С, даже из сравнительно эволюционно далеких организмов (низшие грибы – дрожжи и человек - приматы), вероятно, объясняется тем, что цитохром С играет важнейшую роль в функционировании системы окислительного фосфорилирования, жизненно важной для клетки и тесно взаимодействует с ее элементами.

Консенснусные мотивы, выявленные в первичной структуре, примыкают к гему и служат для его прикреплению к белковой цепи. ТО, что они сохраняются среди всех изученных цитохромов С объясняется тем, что наиболее важную роль в выполнением биологических функций цитохрома С – переноске электрона в электрон-транспортных цепях – играет именно простетическая группа; действительно, многочисленными исследованиями установлено, что перенос цитохромом электрона сопряжен с изменением степени окисления гемового железа (см. Введение). Вероятно, даже малейшая мутация в этих мотивах приводит к летальной мутации и поэтому не закрепляется в процессе эволюции.

Область гомологии в пространственной структуре также плотно примыкает к гему, причем она существенно больше по размерам консенснусных мотивов в первичной структуре и включает их в себя. Известно, что пространственная структура может сохранять гомологию и в том случае, если полного сохранения в первичной последовательности нет; как правило, в этом случае аминокислотные остатки, образующие эту область третичной структуры, могут быть подвержены консервативным заменам. То, что область высокой гомологии в пространствнной структуре тоже примыкает к гему, также указывает на исключительно важную роль гема в выполнении цитохромом С своих функций. Важным результатом сравнения областей, гомологичных в первичной и пространственной структуре является то, что область гомологии в пространственной структуре цитохрома С существенно выше, чем в его аминокислотной последовательности. Вероятно, эта область структуры цитохрома С необходима для выполнения им функций, но совершенно неизменными для выполнения цитохромом С своих функций должны оставаться только достаточно небольшое количество аминокислот. Возможно, аминокислоты консенснусного мотива играют ключевую роль в переносе электрона при окислении – восстановлении железа, и обеспечивают для этого специфическое распределение электронной плотности.

Таким образом, в результате выполнения работы было установлено, что наиболее важен для функционирования цитохрома С гем, простетическая группа.

1. Аминокислотные последовательности и пространственные структуры цитохромов С из различных организмов гомологичны, что указывает на то, что цитохром С играет одну из ключевых ролей в функционировании системы клеточного дыхания.

2. Два консенсусных мотива, сохраняющихся среди цитохромов С различных организмов, является местом крепления гемма к полипептидной цепи, что указывает на то, что простетическая группа является неотъемлимы элементом цитохрома С, совершенно необходимым для его функционирования.

3. Участок пространственной структуры, сохраняющийся среди всех изученных цитохромов С также окружает гем, но он существенно крупнее сохраняющихся в первичной структуре мотивов, что, возможно, свидетельствует об особой роли аминокислотных остатков, примыкающих непосредственно к гемму, в переносе электрона.

Комментарии


Войти или Зарегистрироваться (чтобы оставлять отзывы)