Учеба  ->  Науки  | Автор: | Добавлено: 2015-03-23

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы

Истоки науки о ферментах восходят к древним временам, когда человек впервые столкнулся с ферментативными процессами – спиртовым брожением, заквашиванием и др. Еще на заре цивилизации наши предки заинтересовались причинами превращения виноградного сока в вино, молока – в простоквашу. Они тогда не знали, что причиной этих явлений были ферменты, образованные живыми организмами – дрожжами и бактериями. Только в XIX веке впервые был получен препарат фермента. И лишь в 30-х годах XX веке некоторые ферменты были получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии.

В настоящее время энзимология – наука о ферментах, превратилась в отрасль знаний, которая тесно связана со многими другими науками, особенно – биохимией, физической химией, молекулярной биологией, генетикой и химической технологией. Информация, полученная при изучении ферментов, позволила понять механизмы многих жизненных процессов, таких как фотосинтез, дыхание, биологическое окисление, брожение, синтез множества необходимых для роста органических веществ. Большой интерес данные энзимологии представляют для различных химических производств. Ведь ферменты обладают способностью намного больше увеличивать скорость химической реакции, чем минеральные катализаторы, энзимы не загрязняют окружающую среду, а если рассматривать их как ингибиторы. , то они могли бы сохранить на более длительное время созданные человеком технические средства, предметы быта и т. д. Следовательно, изучение ферментативного катализа представляет как практический так и теоретический интерес и делает актуальной данную работу. Кроме того тема представляет интерес в связи с ее новизной и активным изучением в настоящее время после некоторого застоя.

В данном исследовании уделено большое внимание теоретическим вопросам катализа и, особенно, ферментативного катализа, строению и свойставам энзимов и истории изучения ферментов. Но эта работа была бы не возможна без знакомства с трудами таких великих химиков, как Йенс Якоб Берцелиус, Константин Сигизмундович Кирхгоф, Юстус Либих, Фридрих Вёлер, Гавриил Гавриилович Густавсон, Артур Гарден (Харден), Ганс Карл Август Симон фон Эйлер-Хельпин,Владимир Николаевич Ипатьев, Александр Флеминг, Александр Иванович Опарин, Симон Залманович Рогинский, Илья Васильевич Березин, Эдуард Бухнер, Джеймс Бетчеллер Самнер.

Немалое внимание уделено практической части, которая подтверждает особые свойства ферментов, как биологических катализаторов. Этот вопрос рассматривается на примере каталазы, отвечающей за процессы разрушения перекиси водорода в живых клетках.

Работа содержит приложения, иллюстрирующие особенности протекания ферментативных реакций, строение молекулы каталазы.

1. Понятие о катализе

Катализ – процесс, заключающийся в изменении скорости химических реакций в присутствии веществ, называемых катализаторами.

Катализаторы – вещества, изменяющие скорость химической реакции, которые могут участвовать в реакции, входить в состав промежуточных продуктов, но не входят в состав конечных продуктов реакции и после окончания реакции остаются неизменными.

Каталитические реакции – реакции, протекающие в присутствии катализаторов.

Положительным называю катализ, при котором скорость реакции возрастает, отрицательным (ингибированием) – при котором она убывает. Примером положительного катализа может служить процесс окисления аммиака на платине при получении азотной кислоты. Примером отрицательного – снижение скорости коррозии при введении в жидкость, в которой эксплуатируется металл, нитрита натрия, хромата и дихромата калия.

Катализаторы, замедляющие химическую реакцию, называются ингибиторами.

Разумеется, как катализатор ускоряет реакцию не просто своим присутствием, а взаимодействуя с веществом, подвергающимся превращению. Разберем такой пример. Оксид серы (II) (сернистый ангидрид) при взаимодействии с кислородом окисляется в оксид серы (III) (серный ангидрид):

SO2+½O2=SO3(1)

Если к этой реагирующей смеси добавить диоксид азота, то образование SO3 ускоряется. Это происходит потому, что в присутствии диоксида азота начинается еще одна реакция, ведущая тоже к образованию SO3:

SO2+NO2=SO3+NO(2)

Образующийся оксид азота в свою очередь может окисляться кислородом, снова превращаясь в диоксид:

NO+½O2=NO2(3)

Это обстоятельство и позволяет выделить диоксид азота как катализатор среди прочих реагентов. Поскольку диоксид азота не расходуется (точнее, сначала расходуется, но тут же и регенерируется), его можно добавлять в небольших «каталитических» количествах, в то время как другие реагенты (SO2 и O2) требуются в эквимолярных, стехиометрических количествах.

Таким образом в смеси одновременно протекают реакция (1) и система реакций (2) и (3). Реакции (2) и (3) образуют единый процесс, поскольку это последовательные реакции:

Начало и конец этой схемы одинаковы, поэтому ее можно представить так:

Из схемы видно, что катализатор совершает циклические превращения, принимая попеременно формы NO2 и NO, и в ходе этих превращений осуществляет перенос атома кислорода на молекулу SO2. Следовательно, одна молекула катализатора может превратить в SO3 сколько угодно большое количество SO2.

В реакции (1) и в системе реакций (4) исходные вещества и конечные продукты одинаковы, различны лишь пути. Иначе говоря, катализатор открывает новый, дополнительный путь превращения исходных веществ в продукты реакций и тем самым увеличивает скорость образования продукта. Если скорость каталитического процесса такая же, как скорость некаталитической реакции, то после добавления катализатора общая скорость образования продукта возрастает вдвое. Следовательно, можно сказать, что суть каталитических реакций не столько в том, что скорость их велика (она может быть и небольшой), сколько в том, что они заключают в себе циклический процесс, в котором один из реагентов (катализатор) претерпевает попеременные превращения из одной формулы в другую, затем снова в первую и т. д. , перерабатывая в каждом цикле по одной молекуле исходного вещества в продукт.

В организмах в процессе биологической эволюции, а также в технике при разработке химических технологических процессов отбирались в качестве катализаторов такие вещества, реакции с которыми протекают очень быстро – в тысячи, миллионы и даже миллиарды раз быстрее, чем соответствующие некаталитические реакции. Такое различие скоростей позволяет вообще пренебречь некатализируемым процессом и считать, что все вещество подвергается превращению при участии катализатора. Рассмотренный выше каталитический процесс (4) составляет основу нитрозного метода получения серной кислоты; скорость этого процесса настолько выше скорости некаталитической реакции (1), что практически все молекулы SO2 превращаются в молекулы SO3 при участии NO2, т. е. вкладом реакции (1) в образование продукта можно пренебречь. В организме человека ежесуточно распадается около 0,5 кг глюкозы до CO2 и H2O; в отсутствии катализаторов для этого при тех же физических условиях потребовалось около 10000 лет. Таким образом, и в этом случае можно считать, что практически вся глюкоза в организме распадается в катализируемых реакциях.

Рассмотренный выше пример катализа (синтез SO3) представляет собой ковалентный катализ: катализатор образует ковалентное соединение с исходным веществом. Существует и нековалентный катализ: в этом случае катализатор соединяется с реагентами за счет слабых взаимодействий, например адсорбционных. Однако во всех случаях общим для катализа является то, что катализатор открывает новый путь превращения вещества через новые промежуточные состояния в те же продукты, которые могут образоваться и без катализатора. В реакциях, катализируемых ферментами, в промежуточных продуктах возникают как ковалентные, так и нековалентные связи.

Скорость реакции чаще всего определяется энергией активации, т. е. той энергией, которую нужно сообщить молекулам, чтобы началось химическое превращение: чем больше энергия активации, тем меньше скорость реакции. Энергия активации зависит от природы реагирующих молекул, от их внутреннего строения. Например, энергия активации реакции SO2 с кислородом больше, чем энергия активации реакции SO2 с NO2. Источником энергии активации обычно служит тепловое движение молекул (поэтому при повышении температуры скорость реакции увеличивается).

Энергия активации быстро протекающих катализируемых реакций ниже, чем энергия активации соответствующих некатализируемых реакций. На этом основании часто говорят, что катализатор снижает энергию активации реакции. Однако надо помнить, что катализируемая реакция – это другая реакция, и было бы точнее говорить, что в присутствии катализатора реакцию с высокой энергией активации заменяет реакция с низкой энергией активации.

В зависимости от того, находится катализатор в той же фазе, что и регулирующие вещества, или образует самостоятельную фазу, говорят о гомогенном и гетерогенном катализе.

Примером гомогенного катализа является разложение пероксида водорода в присутствии ионов йода. Реакция протекает в две стадии:

H2O2+I2=H2O+I2O

H2O+2I2O=H2O+O2+2I2

При гомогенном катализе действие катализатора связанно с тем, что он вступает во взаимодействие с реагирующими веществами с образованием промежуточных соединений, это приводит к снижению энергии активации.

При гетерогенном катализе ускорение процесса обычно происходит на поверхности твердого тела – катализатора, поэтому активность катализатора зависит от величины и свойств его поверхности. На практике катализатор обычно наносят на твердый пористый носитель. Механизм гетерогенного катализа сложнее, чем у гомогенного.

Механизм гетерогенного катализа включает пять стадий, причем все они обратимы:

Диффузия реагирующих веществ к поверхности твердого вещества.

Физическая адсорбция на активных центрах поверхности твердого вещества реагирующих молекул и затем хемосорбция их.

Химическая реакция между реагирующими молекулами

Десорбция продуктов с поверхности катализатора.

Диффузия продукта с поверхности катализатора в общий поток.

Примером гетерогенного катализа является окисление SO2 в SO3 на катализаторе NO при производстве серной кислоты (контактный метод).

Промоторы (или активаторы) – вещества, повышающие активность катализаторов. При этом промоторы могут сами и не обладать каталитическими свойствами.

Каталитические яды – посторонние примеси в реакционной смеси, приводящие к частичной или полной потери активности катализатора. Так, следы мышьяка, фосфора вызывают быструю потерю катализатором NO активности (контактный метод производства H2SO4).

Многие важнейшие химические производства, такие как получение серной кислоты, аммиака, азотной кислоты, синтетического каучука, ряда полимеров и др. , проводятся в присутствии катализаторов.

Биохимические реакции в растительных и животных организмах ускоряются биохимическими катализаторами – ферментами.

Скорость процесса – чрезвычайно важный фактор, определяющий производительность оборудования химических производств. Поэтому одна из основных задач, поставленных перед химией научно-технической революцией, - это поиск путей увеличения скорости реакции. Другая важная задача современной химии, обусловленная резко возрастающими масштабами производства химических продуктов, - повышение избирательности химических превращений в полезные продукты, уменьшение количества выбросов и отходов. С этим связана, кроме того, и охрана окружающей среды и более рациональное использование истощающихся, к сожалению, природных ресурсов.

Для достижения всех этих целей нужны верные средства, такими средствами служат прежде всего катализаторы. Однако изыскивать их не так просто. В процессе познания внутреннего устройства окружающих нас вещей ученые установили определенную градацию, иерархию уровней микромира. Это мир молекул, взаимные превращения которых составляют предмет химии. Видимо, нет надобности говорить о том, что молекулы построены из атомов, а последние из ядра и окружающей электронной оболочки; что свойства молекул зависят от природы составляющих их атомов и последовательности соединения их друг с другом; что химические и физические свойства веществ зависят от свойств молекул и характера их взаимосвязи. Остановимся на вопросах с представлением скорости химических реакций.

Взаимные превращения молекул протекают с самой различной скоростью. Скорость можно изменять, нагревая или охлаждая смесь реагирующих молекул. При нагревании скорость реакции, как правило, возрастает, но это не единственное средство ускорения химических превращений. Существует еще один, более эффективный способ – каталитический, широко используемый в наше время в производстве самых разнообразных продуктов.

Первые научные представления о катализе возникли одновременно с развитием атомной теории строения вещества. В 1806 году, через год после того, как один из создателей современной атомной теории Дальтон сформулировал в «Записках Манчестерского литературного и философского общества» закон кратных отношений, Клеман и Дезорм опубликовали подробные данные об ускорении процесса окисления сернистого газа в присутствии азота при камерном производстве серной кислоты. Шесть лет спустя в «Технологическом журнале» Кирхгоф изложил результаты своих наблюдений об ускоряющем действии разбавленных минеральных кислот на гидролиз крахмала и глюкозы. Этими двумя наблюдениями была открыта эпоха экспериментального изучения необычных для того времени химических явлений, которым шведский химик Берцелиус дал в 1835 году общее название «катализ» от греческого слова «каталоо» - разрушать. Такова, коротко, история открытия катализа, который с полным основанием следует отнести к одному из фундаментальных явлений природы.

Теперь следует дать современное и наиболее общепринятое определение катализа, а затем и некоторую общую классификацию каталитических процессов, так как именно с этого начинается любая точная наука. Как известно, «физика – это то, чем занимаются физики (то же самое можно сказать и о химии)». Следуя этому наставлению Бергмана можно было бы ограничиться утверждением, что «катализ – это то, чем занимаются и химики и физики». Но, естественно, такого шутливого объяснения не достаточно, и со времен Берцелиуса давалось множество научных определений понятию «катализ». Но наилучшее определение сформулировано Г. К. Вересковым: «Феноменологически катализ можно определить как возбуждение химических реакций или изменение их скорости под действием веществ – катализаторов, многократно вступающих в промежуточные химические взаимодействия с участниками реакции и восстанавливающих после каждого цикла промежуточных взаимодействий свой химический состав».

Самое странное в этом определении – это заключительная часть, о том, что вещество, ускоряющее химический процесс, не расходуется. Если нужно ускорить движение тяжелого тела, его подталкивают и, следовательно, затрачивают на это энергию. Чем больше потрачено энергии, тем большую скорость приобретает тело. В идеальном случае количество затрачено энергии будет точно равно приобретенной телом кинетической энергии. В этом проявляется фундаментальный закон природы – сохранения энергии.

2. История развития учения о катализе

Долгое время ученые е видели причину реакций в действии химического сродства, которое может либо усилиться, либо уменьшиться под влиянием внешних агентов – теплоты и света. Но в химии уже были накоплены наблюдения, говорящие о существовании и довольно широком распространении особой категории превращений неорганических и органических веществ, весьма отличных от обычных реакций, обусловленных химическим сродством. Еще в 1666 году Н. Лефевр и Н. Лемери проводили опыты по окислению сернистого газа оксидами азота. С начала 90-х годов XVIII в. подробным изучением этого процесса занялись Н. Клеман и Ш. Дезорм во Франции.

В конце XVIII в. значительно расширяется производство серной кислоты, которую получали при сжигании серы в присутствии селитры. Многие ученые в то время думали, что селитра необходима для окисления серы: она отдает весь свой кислород и превращает серу в SO3. Однако Н. Клеман и Ш. Дезорм показали, что если предположить, что весь кислород селитры идет на окисление сернистой кислоты в серную (т. е. SO2 в SO3), то оказывается, что кислорода далеко не достаточно, ибо количество кислорода, заключающееся в той порции селитры, которая употребляется при камерном процессе, составляет всего лишь 0,1 количества кислорода, необходимого для превращения сернистой кислоты в серную.

Н. Клеман и Ш. Дезорм пришли к выводу, что ключ к разгадке камерного процесса заключается в тех красно-бурых оксидах азота, которые в большом количестве переходят в свинцовую камеру. Опытным путем они нашли, что при соприкосновении оксидов азота с сернистой кислотой непременно происходит превращение сернистой кислоты в серную. Низший оксид азота окисляется атмосферным кислородом и вновь передает часть своего кислорода сернистой кислоте. Процесс этот продолжается до тех пор, пока «вся сернистая кислота, или атмосферный кислород, или оба не истощатся». Н. Клеман и Ш. Дезорм обратили внимание на то, что количество оксида азота в процессе образования серной кислоты не изменяется. Они считали, что азотная кислота представляет собой ничто иное, как средство для полного окисления серы. Азотистый газ «берет» кислород атмосферного воздуха, чтобы передать его сернистой кислоте. Так впервые было дано объяснение каталитического камерного процесса получения серной кислоты с участием промежуточных реакций. Н. Клеман и Ш. Дезорм совершенно ясно высказывали мысль, что данное ими объяснение камерного процесса не ограничивается одним этим частным случаем.

Открытия К. С. Кирхгофа

В 1811 году петербургский академик К. С. Кирхгоф открыл реакцию превращения крахмала в глюкозу в присутствии разбавленных кислот, а несколько позднее (1814) изучил превращение крахмала в глюкозу под влиянием солода. К. С. Кирхгоф изучил действие на крахмал минеральных и органических кислот (серной, соляной, азотной, щавелевой) и нашел, что они, действуя на крахмал, уничтожают студенистое состояние «а сам (крахмал) от действия оных при беспрерывной теплоте превращается в виноградный сахар». Он изучал также влияние концентрации кислот и температуры на скорость гидролиза. «Во многих уже случаях, - писал К. С. Кирхгоф, - удавалось искусству посредством химии подражать действию природы и добывать такие произведения, кои она производит для человеческих нужд очень медлительно или с великой бережливостью». В августе 1811 года он представило в Петербургскую Академию наук три образца сахара и сахарного сиропа, полученные им из картофельного крахмала. На заседании конференции Академии Наук 14 августа 1811 года К. Кирхгоф сообщил, что из 100 фунтов овощей (картофеля) он получил 50 фунтов сиропа и 20 фунтов твердого сахара.

К. С. Кирхгоф установил, что наилучшие результаты гидролиза достигаются при действии на крахмал разбавленной серной кислоты. Он знал, что кислота, во всяком случае в основной своей массе, не вступает в реакцию с крахмалом, ее нейтрализуют после реакции определенным количеством мела. Пытаясь найти способы использовать не только картофельный крахмал для приготовления сахара, но и другие виды крахмала, например крахмал пшеничной муки, К. С. Кирхгоф пытался видоизменить свой способ с целью сделать его более пригодным для гидролиза. При этом он обнаружил, что в пшеничной муке содержится «клейковатое вещество», которое обладает важным и до того неизвестным свойством. Нагревание с ним крахмала при 40 – 600 С в течение 8-10 часов без всякой минеральной кислоты приводило к гидролизу и образованию сахара. Так была открыта биокаталитическая реакция – ферментативное превращение крахмала в сахар. Вслед за этим К. С. Кирхгоф исследовал осахаривание крахмала в присутствии солода. Результаты этих опытов были им доложены 30 ноября 1814 года на заседании Петербургской Академии наук.

Открытие процесса осахаривания крахмала при помощи кислот имело большое практическое и теоретическое значение. Вскоре после этих работ появились сообщения в научных журналах о необычных реакциях, вызванных присутствием различных дополнительных агентов. Так, в 1812 году Ф. Фогель обнаружил, что реакция соединения кислорода с водородом может протекать при низких температурах в присутствии размельченного древесного угля. Это открытие впервые показало возможность ускорения окислительных реакций без повышения температуры. Затем Л. Тенар в 1818-1819 гг. наблюдал распад аммиака и пероксида водорода в присутствии различных металлов и их оксидов, которые сами не подвергались никакому изменению.

Э. Дэви в 1817-1820 гг. и И. В. Деберейнер в 1821-1823 гг. обнаружили своеобразное действие платиновой черни, заключающейся в том, что, оставаясь неизменной, она окисляет на холоде спирт в уксусную кислоту. Так был открыт новый способ окисления органических соединений кислородом воздуха при нормальной температуре. Вопросу о действии платины на гремучую смесь водорода с кислородом уделил также внимание М. Фарадей, изложив результаты своих интересных наблюдений в статье «О способности металлов и других твердых тел соединять газы» (1834).

В 1820-1835 гг. появилось много работ, посвященных изучению взаимодействия газов в присутствии металлов. Было обращено большое внимание на изучение реакции окисления сернистого ангидрида в серный в присутствии «контакта» (платины). Эта реакция легла в основу контактного способа получения серной кислоты (английский патент П. Филипса, 1831).

Роль В. Оствальда в развитии учения о катализе

С 90-х годов XIX в. начинается цикл работ В. Оствальда по катализу. «Всюду мы наталкиваемся на катализ и имеем все основания весьма серьезно им заняться», - писал он С. Аррениусу в 1892 году.

Объясняя, почему именно с 90-х годов XIX в. на передний план физико-химических исследований выдвинулось изучение химической кинетики и катализа, В. Оствальд писал, что «для техники знание законов, управляющих скоростью химической реакции, является вопросом чрезвычайной важности, так как только при знании этих законов возможно овладеть применяемым в каждом случае реакциями. Особенно это важно для медленно протекающих процессов, чтобы быть в состоянии их ускорить, так как для химической индустриивремя – деньги».

Отсутствие общей плодотворной концепции катализа до последней четверти XIX столетия, по мнению В. Оствальда, объяснялось тем, что в химию еще не вошло должным образом понятие времени и не были начаты систематические определения скоростей химических превращений, отражающих наиболее существенную сторону каталитических процессов. Он писал: «Катализатором может служить любое вещество, которое изменяет скорость химической реакции, не появляясь в конечном продукте реакции Катализ есть ускорение медленно протекающих реакций от присутствия посторонних веществ». Такое определение дал В. Оствальд в 1894 году явлениям катализа. Он правильно отмечал, что застой в области исследований по катализу был преодолен вследствие «рациональной выработки понятия», благодаря пониманию того, «что при катализе дело заключается в вопросах химической кинетики». В Оствальд считал необходимым перевести решения вопросов катализа на рельсы химической кинетики и с этих позиций рассматривать механизм и скорость каталитических реакций. Он ввел в качестве меры каталитического действия скорость превращения и тем самым превратил катализ в объект новых количественных исследований. В 1901 году на съезде немецких естествоиспытателей в Гамбурге В. Оствальд сделал доклад о катализе, в котором наметил путь, по которому следует идти в эту «плодородную, но еще мало исследованную страну», открытую Я. Берцелиусом.

В 1888 – 1892 гг. Г. Тамман в Дерпте выполнил серию работ, в которых использовал кинетические представления для анализа ферментативных процессов. Он пришел к следующему общему выводу: «Действие, производимое некоторыми ферментами, в большинстве случаев не может быть вызвано другим ферментом».

Этот вывод, подкрепленный данными о характере протекания некоторых ферментативных процессов, предвосхищает представления о специфичности ферментативного действия, которые были блестяще развиты Э. Фишером (1894) в его работах по ферментам. В 1897 году Э. Бухнер путем выжимания под гидравлическим прессом получил из дрожжей сок (чистый ферментный комплекс), не содержащий живых клеток, но способный вызывать энергичное брожение. Это открытие, на которое Э. Бухнер в 1907 году получил Нобелевскую премию, убедительно доказало справедливость представлений о ферментах как составных компонентах живых организмов, не зависящих от их жизнедеятельности. работы Г. Таммана, Э. Бухнера, Э. Фишера имели важное значение для доказательства общности каталитических и биокаталитических реакций. Они прокладывали дорогу для исследований ферментов методами химии и способствовали созданию современной энзимологии.

Мы рассмотрели основные моменты развития представлений о катализе с XVIII до конца XIX в. В 90-х годах начался новый этап в развитии учения о катализа, связанный с объединением исследований по катализу с учением о скоростях и механизме химически реакций. К началу XX в. получило подтверждение представление об универсальности катализа, к этому времени было доказано, что ферментативные реакции являются разновидностью химических каталитических процессов. Данный вывод имел принципиальное значение для дальнейшего развития биологической химии.

3. Катализ в биохимии

Ферментативный катализ неразрывно связан с жизнедеятельностью организмов растительного и животного мира. Многие жизненно важные химические реакции, протекающие в клетке (что-то около десяти тысяч), управляются особыми органическими катализаторами, именуемыми ферментами, или энзимами. Термину «особый» не следует уделять пристального внимания, так как уже известно, из чего построены эти ферменты. Природа избрала для этого один-единственный строительный материал – аминокислоты и соединила их в полипептидные цепи различной длины и в разной последовательности.

Это так называемая первичная структура фермента, где R – боковые остатки, или важнейшие функциональные группы белков, возможно вступающие в качестве активных центров ферментов. На эти боковые группы и ложиться основная нагрузка при работе фермента, пептидная же цепь играет роль опорного скелета. Согласно структурной модели Полинга – Кори, она свернута в спираль, которая в обычном состоянии стабилизирована водородными связями между кислотными и основными центрами.

Для некоторых ферментов установлены полный аминокислотный состав и последовательность расположения их в цепи, а также сложная пространственная структура. Но это все же очень часто не может помочь нам ответить на два главных вопроса:

Почему ферменты так избирательны и ускоряют химические превращения молекул только вполне определенной структуры (которая нам тоже известна)?

Каким образом фермент снижает энергетический барьер, т. е. выбираете энергетически более выгодный путь, благодаря чему реакции могут протекать при обычной температуре?

Строгая избирательность и высокая скорость – два основных признака ферментативного катализа, отличающие его от лабораторного и производственного катализа. Ни один из созданных руками человека катализаторов не может сравниться с ферментами по силе и избирательности воздействия на органические молекулы.

Активность фермента, как и любого другого катализатора, тоже зависит от температуры: с повышением температуры возрастает и скорость ферментативной реакции. При этом обращает на себя внимание резкое снижение энергии активации Е по сравнению к некаталитической реакцией. Правда, это происходит не всегда. Известно много случаев, когда скорость возрастает благодаря увеличению не зависящего от температуры предэкспоненциального множителя в уравнении Аррениуса.

Активность ферментов зависит от кислотной среды, в которой протекает химическая реакция. Примечательно, что кривая этой зависимости от pH среды напоминает колоколообразные кривые кислотно-основного катализа.

Увеличение кислотности среды будет благоприятно для одних элементарных стадий и неблагоприятно для других. При наличии таких конкурирующих фактов, как нетрудно догадаться, должна существовать некоторая оптимальная кислотность среды, при которой фермент может работать с максимальной эффективностью.

Анализ зависимостей скоростей от pH является весьма эффективным средством идентификации функциональных групп белковой молекулы фермента, участвующих в процесс активации молекул субстрата. Зная природу активных центров, можно представить себе, как она работают. Конечно, при этом приходиться пользоваться теми же представлениями о механизме элементарных актов, которые сложились при изучении обычных реакций органической химии. Вводить какие-то особые механизмы нет никакой необходимости. Работа фермента сводится в конечном счете к совокупности простых операций, аналогичных тем, которые совершаются при взаимодействии органических молекул в обычных пробирочных условиях.

1) в ферментативном катализе принимают участие по крайней мере две функциональные группы, и механизм ферментативной реакции включает в себя определенную последовательность элементарных актов, которая обеспечивает энергетически более выгодный маршрут, чем неферментативная реакция;

2) активные центры на полипептидной цепи расположены так, чтобы в определенной момент и в определенном месте ни могли взаимодействовать с молекулой субстрата и осуществить серию согласованных химических актов.

4. Ферменты – биологические катализаторы белковой природы

Ферменты присутствуют во всех живых клетках. Принято разделять ферменты на простые и сложные, или однокомпонентные и двухкомпонентные. Простые ферменты состоят только из белка, сложные из белка и небелковой части, которую называют коферментом.

Ферменты отличаются высокой каталитической активностью и избирательностью. По каталитической активности они значительно превосходят неорганические катализаторы. Например, 1 моль каталазы при 0 0С разлагает за одну секунду 200000 молей Н2О2, а 1 моль платины при 20 0С разлагает за одну секунду от 10 до 80 молей перекиси водорода.

Такие ускорения реакции связаны с тем, что ферменты резко снижают энергетические барьеры на реакционном пути. Например, энергия активации для реакции распада Н2О2 под действием иона железа (II) и молекул каталазы соответственно равна 42 и 7,1 кДж/моль; для гидролиза мочевины кислотой и уреазой – соответственно 103 и 28 кДж/моль.

Ферменты по сравнению с неорганическими катализаторами весьма специфичны. Например, амилаза, содержащаяся в слюне, легко и быстро расщепляет крахмал, но не катализирует процесс распада сахара. Уреаза исключительно эффективно катализирует гидролиз мочевины, но не оказывает никакого воздействия на ее производные. Такая особенность ферментов позволяет живым организмам, имея соответствующий набор ферментов, активно откликаться на воздействие извне. Например, замечено, что в стрессовых ситуациях наш организм проявляет удивительные возможности. Описан факт, когда слабая женщина подняла за бампер легковой автомобиль и удерживала его, пока поспевшие люди освобождали попавшего под него ребенка; человек, преследуемый разъяренным животным, легко преодолевает препятствия, непреодолимые для него в обычном состоянии; на ответственных соревнованиях спортсмены теряют в весе по нескольку килограммов за период выступления.

Все сказанное о замечательных свойствах ферментов объясняется тем, что избирательность действия (селективность) и активность взаимосвязаны: чем выше селективность, тем выше и его активность. Ферменты обладают уникальной селективностью, поэтому и активность их наивысшая.

Ферментативный катализ лежит в основе жизнедеятельности всех организмов. В химические функции живых клеток входит разложение и синтез белков, жиров, углеводов и других очень сложных веществ. Благодаря высокой специфичности и активности ферментов за короткое время и при низких температурах в живом организме образуются необходимые для жизнедеятельности соединения.

Большое значение имеет ферментативный катализ в пищевой технологии. Известно, что одним из основных процессов приготовления хлеба является брожение теста. Сахара, содержащиеся в муке, сбраживаются дрожжами с образованием CO2. Содержание собственных сахаров в муке невелико, и они не обеспечивают интенсивного газообразования. Но в муке есть ферменты амилазы, которые могут расщеплять крахмал. В процессе брожения теста они поддерживают необходимую концентрацию моно- и дисахаридов.

В производстве плодово-ягодных соков пектолитические ферментные препараты применяют для повышения выхода сока, его осветления и стабилизации.

Перспективно применение фермента глюкоизомеразы в крахмалопаточной промышленности. Одним из продуктов, выпускаемых этой промышленностью, является глюкоза, которую получают гидролизом крахмала. Глюкозоизомераза может превращать часть глюкозы в растворе во фруктозу. В результате получается жидкий сироп, состоящий из глюкозы и фруктозы, по сладости не уступающий сахарному сиропу такой же концентрации.

Благодаря промышленности микробиологического синтеза ферменты стали более доступны. Это позволяет применять их не только в пищевой промышленности. Их добавляют в СМС, предназначенные для стирки белья.

5. История изучение ферментов

Истоки науки о ферментах восходят к технологическим процессам, применявшимся человеком еще на заре цивилизации, таким, как спиртовое брожение, вызываемое дрожжами, использование поросших зерен ячменя (солода) для осахаривания крахмалистого сырья, применение заквасок при изготовлении хлеба.

Изучение ферментов представляет собой интерес, так как эта область знания находиться на стыке биологических и физических наук. С одной стороны, ферменты имеют исключительное значение в биологии. Жизнь зависит от сложной совокупности химических реакций, осуществляемых специфическими ферментами, и любое изменение действия ферментов может повлечь за собой серьезные последствия для живого организма. С другой стороны, ферменты как катализаторы, все больше и больше привлекают внимание физикохимиков. Изучение механизма действия ферментов представляет собой одну из самых увлекательных областей современного научного исследования.

В настоящее время наука о ферментах – энзимология – превратилась в обширную бурно развивающуюся отрасль знания с многочисленными ответвлениями, тесно связанную со многими науками, особенно с биохимией и молекулярной биологией, физической химией, бактериологией и микробиологией, генетикой, ботаникой и сельским хозяйством, фармакологией и токсикологией, физиологией, медициной и химической технологией. Кроме того, она имеет важное практическое значение. Многие исследователи в различных странах сосредотачивают свои усилия на решении проблем энзимологии; созданы специальные институты для изучения ферментов. все большее число журналов печатает статьи по энзимологии, и литература по различным разделам этой ветви науки в настоящее время очень обширна.

В 1814 г. член Петербургской академии наук К. С. Кирхгоф обнаружил, что вытяжка из солода вызывает превращение крахмала в более простые сахара. Иначе говоря, впервые был получен препарат фермента в виде раствора, а не в составе живых клеток. В 1897 году немецкий ученый Э. Бухнер прессованием растертых дрожжей получил сок, который также не содержал клеток, но был способен вызывать спиртовое брожение. Такого рода опыты утвердили представление о том, что в живых клетках содержаться вещества, катализирующие определенные реакции, и что эти вещества можно выделять из клеток и изучать методами химии. В 30-х годах XX в. некоторые ферменты были получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии. По химической природе кристаллы оказались белковыми, и это послужило первым надежным докозательством того, что ферменты представляют собой белки.

Иногда трудно себе представить, что энзимология возникла сравнительно недавно; зарождение этой области науки можно отнести к первой половине XIX века, но особенно бурное развитие она претерпела в течение последних 40 лет. Хотя явления брожения и переваривания были известны с незапамятных времен, первое ясное представление о ферменте появилось, по-видимому, только в 1833 году, когда Пайен и Персо обнаружили в осадке, образующимся при добавлении спирта к солодовому экстракту, термолабильное вещество, обладающее способностью превращать крахмал в сахар. Это вещество, которое теперь называется амилазой, было названо ими диастазой (от греч. δiαστασis – разделение) за его способность отделять растворимый декстрин от нерастворимой оболочки крахмальных зерен. Название «диастаза» впоследствии было распространено на все ферменты как общее наименование.

В 1898 году Дюкло предложил последние три буквы этого видового названия (суффикс «аза») прибавлять к корню названия того вещества, на которое данный фермент действует. Этот принцип был положен в основу применяемой ныне номенклатуры ферментов; однако несколько названий пищеварительных ферментов, оканчивающихся на «ин», сохранились до настоящего времени. Поскольку число ферментов продолжает увеличиваться, в названии фермента стали указывать не только природу вещества, на которое он действует, но также и характер катализируемой реакции (например, лактатдегидрогеназа).

Сразу же после открытия ферментов многие исследователи обратили внимание на сходство между их действием и действием дрожжей при брожении. Так появился термин «фермент» (от лат. fermentation – брожение). Во второй половине XIX века разгорелся большой спор между Либихом, придерживавшимся того взгляда, что брожение и сходные процессы обусловлены действием химических веществ, и Пастером, утверждавшим, что брожение неотделимо от жизнедеятельности клеток. Отсюда возникло разделение ферментов на «неорганизованные» и «организованные», т. е. , как сказали бы мы теперь, на экстрагируемые ферменты и ферменты, функционирующие в живой клетке. Для того чтобы избежать применения этих неудобных наименований, Кюне в 1878 году ввел в употребление термин «энзим». Поскольку среди ученых были распространены неправильные представления о причинах, побудивших Кюне предложить этот термин, процитируем высказывание самого Кюне:

«Таким образом, мы не намереваемся выдвигать какую-либо особую гипотезу, а только констатируем : в дрожжах (εν ζνχη) имеется что-то, что обладает той или иной ферментативной активностью. Название энзим, однако, применимо не только к инвертину дрожжей. Оно должно подчеркнуть, что более сложные организмы, из которых можно получить такие ферменты, как пепсин, трипсин и т. п. , не столь резко отличаются от одноклеточных организмов, как это иногда принято думать». Кюне хотел подчеркнуть, что фермент находится в дрожжах, и вместе с тем противопоставить его самим дрожжам.

Спор Пастера и Либиха был разрешен после того, как Бухнеру удалось получить систему ферментов, осуществляющих брожение, из дрожжевого экстракта, не содержащего дрожжевых клеток. Однако название «фермент» сохранилось в Германии до настоящего времени.

К концу XIX века благодаря замечательным успехам в изучении структуры органических веществ, представляющих биологический интерес, стало возможным изучение пределов действия ферментов, или их так называемой специфичности. Развитием представления о специфичности ферментов и близком стерическом соответствии между ферментом и субстратом мы обязаны Эмилю Фишеру. На основании своих наблюдений над субстратами известной структуры Фишер выдвинул свое знаменитое положение о том, что субстрат подходит к ферменту так, как ключ подходит к замку Изучение специфичности составляет в настоящее время очень важный раздел учения о ферментах. Вследствие определенного соответствия между ферментом и субстратом фермент может действовать только на очень ограниченный ряд субстратов, и это является причиной существования множества различных ферментов. Надежное изучении специфичности ферментов, разумеется, невозможно без выделения индивидуальных ферментов в чистом виде.

До 1920 года сколько-нибудь серьезных работ по получению ферментов в чистом виде не было. Большинство ранних экспериментов такого рода проведены Вильштеттером и его сотрудниками между 1922 и 1928 гг. Несколько работ были выполнены в течение того же периода и другими исследователями (в качестве примера можно привести опыты Диксона и Кодама по очистке ксантиноксидазы), но ни в одном из этих случаев не удалось достичь полной очистки. Следующим важным шагом было получение ферментов в кристаллическом виде. Первым ферментом, полученным в кристаллическом виде, оказалась уреаза, кристаллы которой получил Самнер в 1926 году. Однако эти первые кристаллы были далеко не чистыми. За этой работой вскоре последовала серия классических работ Нортропа и его сотрудников по выделению в кристаллическом виде протеолитических ферментов. И хотя еще 35 лет назад число полученных в чистом виде ферментов было очень мало, в наше время число ферментов, полученных в чистом виде и кристаллическом виде, уже превышает 200, а число ферментов, очищенных до той или иной степени превышает 1500.

Первая работа по очистке ферментов была встречена резкой критикой. Критики указывали, что «нефизиологично» выделять ферменты из клетки и что ценность представляют только те исследования, которые проводятся на неповрежденных клетках. Позднее, когда были получены первые белковые кристаллы, обладающие высокой ферментативной активностью, возникли сомнения относительно возможности кристаллизации самих ферментов. Предполагалось, что ферменты лишь адсорбированы на кристаллах инертного белка. Нортроп, однако, привел убедительные доказательства, что полученные им белковые кристаллы сами являются ферментами. С тех пор были выделены в чистом виде многие ферменты. Причем все они оказались белками. Таким образом, представление о ферменте с течением времени менялось. Сначала этим словом обозначали неопределенные влияния или свойства, присущие некоторым препаратам, потом определенные химические вещества и, наконец, специфические белки.

Основное внимание в ранний период развития энзимологии было сосредоточено на изучении ферментов пищеварения и брожения; лишь значительно позднее была осознана важная роль внутриклеточных ферментов. Фактически серьезных работ по очистке внутриклеточных ферментов не было до 1937 года, несмотря на то, что в естественных условиях вне живых клеток встречается сравнительно мало ферментов. Однако с 1937 года положение кардинально изменилось, и то громадное число ферментов, которые известны в настоящее время, обусловлено главным образом открытием новых внутриклеточных ферментов. Огромная информация, плоченная при изучении этих ферментов, привела в свою очередь к значительно более глубокому пониманию механизма многих фундаментальных жизненных процессов, особенно лежащих в основе жизни процессов метаболизма, связанных с накоплением и использованием энергии. Наши знания о таких процессах, как фотосинтез, дыхание, биологическое окисление, брожение, синтез множества необходимых для роста органических веществ, выполнение механической или осмотической работы, значительно пополнились благодаря выделению и изучению ферментов, ответственных за эти процессы.

Наиболее фундаментальной проблемой энзимологии является установление механизма действия ферментов, выяснения вопроса о том, каким образом химическое строение ферментов обеспечивает их исключительно высокую и специфическую каталитическую активность. До сравнительно недавнего времени детальные данные о химическом строении ферментов отсутствовали и изучать указанную проблему можно было только непрямыми методами. Так, например, в результате исследования кинетики действия ферментов (это направление получило значительное развитие после классических исследований Брауна, Анри, Михаэлиса, опубликованных в начале века) оказалось возможным во многих случаях выявить последовательные стадии ферментативных реакций и высказать предположения относительно механизма действия ферментов.

Важная информация о природе участвующих в катализе химических групп молекулы ферментов была получена как при исследовании уникальной специфичности ферментов, которая не свойственны другим катализаторам, так и при изучении действия ингибиторов и реагентов, атакующих определенные химические группы.

Именно возможность получения ферментов в чистом виде привела к успешному развитию структурной энзимологии в последнее время. Исследование чистых ферментов с помощью специальных химических методов (в которых сами чистые ферменты используются в качестве инструментов) позволило определить полные последовательности аминокислот в полипептидных цепях молекул ферментов. Далее, с помощью метода рентгеноструктурного анализа была установлена детальная трехмерная структура молекул некоторых ферментов, полученных в кристаллическом состоянии. была определена конформация пептидных цепей, расположение различных групп, образующих субстратсвязывающий участок, и характер взаимодействия последнего с молекулой субстрата. Естественно, что эти новые данные явились значительным вкладом в понимание механизма катализа. Располагая данными о полной структуре относительно простого фермента, оказалось даже возможным чисто химическими методами синтезировать в лаборатории каталитически активный фермент.

Исследования последнего времени способствовали также выяснению механизма биосинтеза ферментов в живых клетках и способа кодировании их химической структуры в генетическом материале хромосом. Биосинтез ферментов осуществляется чрезвычайно интересной, но крайне сложной системой, в которой участвует ряд других ферментов.

Наконец, не следует забывать, что ферменты имеют столь большое значение вследствие того, что сама жизнь тесно связана с ферментативным катализом. По необходимости развитие энзимологии происходило главным образом в направлении исследования изолированных ферментов. Только в последние годы появились возможности для изучения биологической стороны предмета, т. е. для изучения ферментов и ферментных систем непосредственно в живой клетке.

Энзимология достигла, по-видимому, уже такой стадии развития, когда в ближайшем будущем можно надеяться пожать обильные плоды всех тех многочисленных исследований, которые были проведены в последние годы в различных направлениях. В настоящее время дальнейшее развитие происходит чрезвычайно быстро. Однако предстоит еще огромная работа; несомненно, многие важные ферменты еще не открыты, а многие из тех, которые обнаружены, почти не охарактеризованы. В настоящее время исследования сосредоточены в основном на сравнительно небольшом числе ферментов, и, вероятно, справедливо утверждать, что мы еще очень мало знаем о структуре 95% уже известных ферментов.

Ферменты являются катализаторами биохимических реакций.

6. Строение ферментов

Структура

Природа ферментов была выяснена сравнительно недавно. Долгое время полагали, что белки представляют собой примеси, сопутствующие ферментам. В 1922 году было установлено, что ферменты сами являются белками. В 1926 году Самнер впервые получил белковые кристаллы фермента уреазы. Затем Нортропу удалось выкристаллизировать большое число других ферментов. В настоящее время уже много сотен ферментов получено в кристаллическом виде и их белковая природа доказана. На основании их строения ферменты делят на две основные группы: 1) полностью белковые ферменты, например рибонуклеаза; 2) ферменты, состоящие из двух частей: белковой, называемой апоферментом, и небелковой, которую называют коферментом.

Коферменты

Непосредственное участие в химической реакции, катализируемой ферментом, принимает не белок, а кофермент. Белок же определяет специфичность реакции на этапе фиксации субстрата. (Субстратом называют химическое соединение, на которое действует фермент. Все биохимические молекулы можно, таким образом, считать субстратами).

Апофермент влияет на характер реакции, идущей на уровне кофермента. Так, например, трансаминазы (ферменты, переносящие аминогруппу с аминокислоты на кетокислоту) и декарбоксилазы аминокислот (катализирующие декарбоксилирование аминокислот) работают с участием одного и того же кофермента – пиридоксальфосфата. Субстратом в обоих случаях может служить одна и та же аминокислота. Очевидно, различный характер реакций связан с разницей в природе соответствующих апоферментов. В некоторых случаях кофермент очень прочно связан с апоферментом и их не удается отделить друг от друга иначе, чем с применением жестких методов, денатурирующих апофермент. В других случаях кофермент отделяется очень легко, путем простого диализа. Это объяснят, почему диализ в некоторых случаях может инактивировать фермент. Для восстановления активности в этих случаях достаточно добавить к ферменту сконцентрированный диализат.

Коферменты – металлы

Большое число ферментов для своего действия нуждается в присутствии металлов. Иногда бывает трудно установить, являются ли эти металлы или ионы металлов коферментами, т. е. входят ли они в состав фермента или же играют роль активаторов ферментов. Несомненно, что если и не всегда, то в большинстве случаев металлы непосредственно участвуют в ферментативной реакции, взаимодействуя с ферментом или субстратом.

Алкогольдегидрогеназа, карбоангидраза Zn

Аргиназа, аминопептидаза Mn

Дипептидаза Co

Фосфатаза, фосфокиназа Mg

Тирозиназа Cu

Сукцинатгедрирование Fe

Ксантиноксидаза Mo

Коферменты – производные водорастворимых витаминов

Уже давно исследуется вопрос о природе действия витаминов. В настоящее время известно, что после трансформации, иногда минимальной, например присоединения фосфата или пирофосфата, а иногда, напротив, очень значительной, витамины превращаются в коферменты.

Активный центр

У ферментов, не имеющих коферментов, ферментативную реакцию осуществляет собственно белок. Непосредственное участие в реакции принимает не вся полипептидная часть белка, а только небольшая ее часть, причем если в реакцию вовлекается несколько аминокислотных остатков, то совсем не обязательно, чтобы они были расположены рядом в полипептидной цепи. Однако они непременно должны быть сближены пространственно, что обеспечивается спецификой трехмерной структуры фермента.

Отсюда ясно, почему денатурация белка инактивирует фермент. Причина состоит в том, что нарушение его трехмерной структуры разобщает пространственно совмещенные аминокислотные остатки. Кроме того, форма молекулы биологически активного фермента играет важную роль в связывании субстрата. Э. Фишер выдвинул в 1894 году гипотезу, согласно которой фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. Форма фермента по Э. Фишеру, такова, что специфический субстрат может подходить и фиксироваться на нем в нужном для реакции месте. Позднее Кошланд предложил другую гипотезу, согласно которой субстрат меняет конформацию активного центра фермента таким образом, чтобы обеспечить наилучшую адаптацию активного центра к субстрату. Это представление получило название концепции индуцируемой адаптации фермента к субстрату. В некоторых случаях удалось показать, что субстрат действительно существенно модифицирует третичную структуру фермента. Известно также, что в присутствии субстрата фермент стабилизируется и оказывается значительно более устойчивым по отношению к денатурирующим агентам.

Активным центром фермента называют совокупность аминокислотных остатков, которые вступают в контакт с субстратом. Фактически следует различать в составе активного центра участок, ответственный за присоединение субстрата, или центр связывания, и каталитический центр, который воздействует на субстрат, заставляя его вступить в химическую реакцию.

Важнейшую роль в пространственном сближении аминокислотных остатков, образующих активный центр, играют дисульфидные связи; однако слабые связи также вносят свой вклад.

В каталитических центрах большей части известных ферментов обычно находят один или несколько остатков из числа следующих аминокислот: серин, цистеин, гистидин, тирозин и лизин. Многие гидролитические ферменты, такие, как протеолитические ферменты, щелочная фосфатаза, эктераза, содержат в своем активном центре остаток серина. В полипептидных цепях химотрипсина и трипсина имеется много одинаковых последовательностей, в особенности вблизи активного центра.

В активном центре многих ферментов, обладающих дегидрогеназной активностью, таких, как фосфоглицеральдегиддегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа, содержится цистеин. Если сопоставить структуру фосфоглицеральдегиддегидрогеназ, выделенных из мышц и из дрожжей, то оказывается, что они довольно сильно отличаются друг от друга, однако в непосредственной близости к активному центру у обеих имеются одинаковые последовательности из 18 аминокислотных остатков.

7. Свойства ферментов

Специфичность

Специфичность действия ферментов следует рассматривать с двух позиций:

1) специфичность по отношению к субстрату. Фермент может действовать только на один определенный субстрат, иногда на группу субстратов, структуры которых (или по крайней мере структуры определенных участков их молекул) очень похожи друг на друга;

2) специфичность характера реакции. Каждый фермент может вести реакцию только одного типа: гидролиз, перенос метильной группы и т. д.

На первых энзимологов производила сильное впечатление высокая степень специфичности ферментов. Так, например, если брать рацемическую винную кислоту, то фермент окисляет только один из ее энантиоморфов, оставляя вторую форму неизменной. Точно так же фермент, катализирующий гидролиз β-метилглюкозида, не оказывает гидролитического действия на α-метилглюкозид. Такая ситуация и привела Э. Фишера к концепции, согласно которой каждый фермент представляет собой как бы ключ, открывающий только один замок. На самом же деле это далеко не так. Действительно, существуют ферменты, характеризующиеся очень высокой специфичностью. Например, аргиназа расщепляет аргинин на орнитин и мочевину, а уреаза преобразует мочевину в карбонат аммония. С другой стороны, липазы гидролизуют все триглицериды, имеющие длинные цепи жирных кислот, а эстеразы ведут гидролиз большого числа различных эфиров. Изомерия и особенно стереоизомерия имеют важное значение для работы ферментов. Ферменты, действующие на глюкозу или на ее производные, узнают только эти производные D-ряда, будь они право- или левовращающими.

На аминокислоты D-ряда и L-ряда действуют разные ферменты. β-глюкозидазы гидролизуют большое число β-глюкозидов независимо от природы спиртового радикала.

Следует отдельно отметить ферменты, катализирующие гидролиз макромолекул – белков и нуклеиновых кислот. Молекулярный вес этих ферментов зачастую ниже, чем у их субстратов. Специфичность таких ферментов относится не к субстрату в целом, а к тому его участку, который атакуется ферментом. Так, например, трипсин действует на большинство белков, гидролизуя их всегда в местах расположения остатков аргинина и лизина.

Свойства ферментов:

1. Сочетание высочайшей активности с соблюдением строгого ряда условий: концентрация фермента, субстрата и коферментов; наличие ингибиторов и активаторов; узкие интервалы температуры и РН среды.

2. Специфичность действия, в основе которой лежит строгое соответствие структуры субстрата и активного центра фермента. Степень специфичности у разных ферментов различна. Выделяют ферменты с: а) относительной специфичностью, когда один фермент действует на несколько веществ, имеющих определенный тип связи (например, эстеразы гидролизируют все соединения с простой эфирной связью –О−, а протеиназы расщепляют вещества с пептидными связями −NH−CO−).

б) абсолютной специфичностью, когда ферменты катализируют превращение только одного субстрата определенной структуры (например, уреаза расщепляет только мочевину, сахараза – только сахарозу).

3. Обратимость действия ферментов. Ферменты могут катализировать как прямую, так и обратную реакцию в зависимости от определенных условий, т. е. их действие в ряде случаев является обратимым. Например, лактатдегидрогеназа катализирует как распад, так и синтез молочной кислоты. Однако обратимость действия присуща не всем ферментам.

Различия между неорганическими катализаторами и ферментами.

Признаки различий Неорганические катализаторы Ферменты

Химическая природа Низкомолекулярные вещества, образованные одним или Белки– высокомолекулярные полимеры несколькими элементами

Селективность Низкая Очень высокая

Оптимум рН Сильнокислая или щелочная Небольшой физиологический интервал рН среды

Изменение структуры катализатора в Изменяется незначительно или не изменяется вовсе Изменяется в значительной степени и восстанавливается ходе реакции в исходную структуру по окончании реакции

Увеличение скорости реакции В 102-106 В 108-1016 раз

8. Классификация ферментов

Официальная классификация ферментов была принята в 1961 году. В соответствии с этой классификацией название фермента должно отражать тип катализируемой им реакции. Все ферменты подразделяются при этом на шесть основных групп. До этого ферменты называли по имени субстрата, просто добавляя к нему суффикс «аза». Соответствующие названия продолжают использовать и в настоящее время, но одновременно с ними для большего числа ферментов пользуются названиями, происходящими от типа катализируемой реакции, добавляя к ним тот же суффикс «аза».

1. Оксиредуктазы. Эти ферменты катализируют реакции окисления и восстановления. Большая часть оксиредуктаз имеет коферменты.

Некоторые из них используют молекулярный кислород, это оксидазы. Гидроксилазы в присутствии молекулярного кислорода преобразует:

−CH3 в −CH2OH

−CH2 в −CHOH−

Дегидрогеназы катализирует отщепление водорода от окисляемых субстратов.

Цитохромы содержат кофермент типа гемма, включающий ион, способный находиться в двух состояниях окисления, благодаря чему они служат переносчиками электронов:

Fe2+Fe3+

1. Трансферазы. Один из очень важных для биологии типов реакций состоит в переносе химический групп. Химическая группа может быть отделена от одной молекулы и перенесена на другую молекулу, не проходя при этом через свободное состояние. Ферменты, катализирующие такого рода реакции – трансферазы, отрывают химическую группу от одного соединения, связывают ее, а затем присоединяют к другому соединению.

- Трансметилазы, например, отщепляют метильную группу от таких соединений, как метионин или бетаин, и переносят ее на другие соединения. В этих реакциях участвуют тетрагидрофолиевая кислота и кофермент B12.

- Трансформилазы производят аналогичную операцию со следующими окисленными одноуглеродными группами: - формильной группой, −CHO и оксиметильной группой, −CH2OH (тетрагидрофолиевая кислота принимает участие в этих реакциях).

- Трансацетилазы переносят ацетильную группу, −CH2COOH. Кофактором этой реакции служит кофермент A.

- Трансаминазы переносят аминогруппы от аминокислот на кетокислоты. Они играют основную роль в метаболизме аминокислот. Коферментом является пиридоксальфосфат.

- Фосфокиназы, или просто киназы, переносят остаток фосфорной кислоты с одной части молекулы на другую.

Фосфатаза −CH2O− +H2O→ −CH2OH+ OH гидролаза

Фосфокиназа −R−O− +АДФ→−R−OH+АТФ трансфераза

Фосфорилаза −Глюкоза−O−Глюкоза + OH → −Глюкоза + Глюкоза-1- трансфераза

Фосфомутаза Глюкоза-6- Глюкоза-1- изомераза (или трансфераза)

Ферменты, действующие на фосфорилированные соединения

3. Гидролазы. Эти ферменты катализирует разрыв химической связи с присоединением элементов молекулы воды.

а) Эстеразы гидролизируют сложные эфиры с образованием кислоты и спирта

R−COO−CH2−R´+H2O→R−COOH+HOH2C−R´ б) Липазы гидролизируют глицериды на глицерин и жирные кислоты.

в) Гликозидазы ведут гидролиз гликозидов на сахарид и спирт.

Их названия происходят от моносахарида, на производное которого они действуют, - глюкозидаза, галактозидаза и т. п. Они обладают специфичностью по отношению к α- или β-конфигурации сахара. Особую категорию составляют ферменты, гидролизирующие дисахариды: мальтаза, лактаза, сахараза.

4. Лиазы катализируют разрыв связей C−C, C−N, C−O, C−S с образованием двойных связей.

Среди лиаз отметим:

- декарбоксилазы кетокислот, коферментом которых служит тиамин пирофосфат. Они катализируют реакцию:

R−CO−COOH − − → R−CHO+CO2

- декарбоксилазы аминокислот, катализирующие превращение аминокислот в амины; коферментом является пиридоксальфосфат;

- альдолазы, катализирующие разрыв гексозофосфатов на две молекулы триозосфатов.

5. Изомеразы. Эти ферменты катализируют самые различные процессы изомеризации.

- Рацемазы катализируют превращение L-аминокислот в D-аминокислоты.

- Эпимеразы вызывают взаимные переходы сахаров, например галактоза→глюкоза.

- Мутазы катализируют перенос химических групп с одной части молекулы в другую. В качестве кофермента здесь часто выступает кофермент B12.

Метилмалонил КоА − − → сукцинил КоА.

6. Лигазы катализируют процессы конденсации двух сочетающихся молекул за счет энергии распада АТФ:

- аминоацил-тРНК синтетазы присоединяют аминокислоту к молекуле транспортной РНК; это первый этап белкового синтеза;

- ацетил-КоА синтетаза катализирует конденсацию уксусной кислоты и кофермента А:

CH3−COOH+KoA−SH− − →CH3−CO−SKoA+H2O

- карбоксилазы связывают СО2 с кетокислотой:

CH3−CO−COOH+CO2− − → HOOC−CH2−CO−COOH

9. Изоферменты

Изоферменты, как и другие изофункциональные белки, выполняют одинаковую функцию, т. е. катализируют одну и ту же реакцию. Однако по ряду свойств изоферменты могут различаться, например, по молекулярной активности, по кинетике реакции, по способам регуляции, по стабильности. В основе особенностей изоферментов лежат генетически обусловленные различия их первичной структуры, обычно небольшие. Формы ферментов, образующиеся в результате модификации их молекул уже после синтеза, не называют изоферментами. Например, не являются изоферментами фосфорилированная и дефосфорилированная липазы жировой ткани.

Приведем в качестве примера изоферментов глюкокиназу и гексокиназа. Обе эти киназы катализируют превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат, но различаются по значению константы Михаэлиса, а также по локализации в организме: глюкокиназа – это фермент печени, а гексокиназа обнаруживается в печени, мышцах и многих других тканях.

Если фермент имеет олигомерную структуру и построен из неидентичных протомеров, то изоферменты могут получаться в результате различных комбинаций протомеров, подобно тому, как это имеет место в случае неферментного белка гемоглобина (гемоглобины A, F, A2). Например, лактатдегидрогеназа представляет собой тетрамер, в котором могут быть протомеры двух типов – Н и М. Возможны пять комбинаций этих протомеров в тетрамерной молекуле: М4, М3Н1, М2Н2, М1Н3 и Н4. Все пять комбинаций реализуются в организме. Протомеры М и Н различаются по электрофоретической подвижности, поэтому изоферменты лактатдегидрогеназы легко разделить методом электрофореза.

Не всегда просто решить, являются ли сходные ферменты изоферментами, или их следует отнести к разным ферментам. В качестве примера укажем на карбамоилфосфатсинтетазы I и II. Оба эти фермента синтезируют карбамоилфосфат, но реакции различаются тем, что первый из них образует аминогруппы за счет аммиака, а второй – за счет амидной группы глутамина. Таким образом, продукт реакций в обоих случаях один и тот же, а субстраты фермента, хотя и сходны, но не идентичны. Карбамоилфосфатсинтетазы I и II различаются и по локализации в клетке, и по физиологической роли. Первый фермент находится в митохондриях, участвует в метаболическом пути синтеза мочевины, а второй – в цитозоле, участвует в синтезе пиримидиновых нуклеотидов. По-видимому, есть равные основания рассматривать эти ферменты и как изоферменты, и как разные ферменты.

10. Особенности ферментативной реакции

Характер ферментативной реакции

Ферменты являются катализаторами, это подразумевает определенные их характеристики: ферменты не изменяются – их структура по окончании реакции остается такой же, какой была до ее начала; ферменты действуют в малых количествах – одна молекула фермента может обеспечить превращение многих сотен и даже миллионов молекул субстрата в минуту; ферменты одинаково ускоряют обратимые реакции в обоих направлениях, однако не смещает равновесия. Другими словами, положение равновесия остается одинаковым как в отсутствие, так и в присутствие фермента, однако добавление фермента ускоряет его достижения.

Энергия активации

Если химическая реакция идет с выделением энергии, она, казалось бы, должна начинаться спонтанно. Однако это не так, ибо компоненты такой реакции должны быть предварительно переведены в активированное (возбужденное) состояние, что требует подвода энергии, так называемой энергии активации. Реакция начинается с того, что активированные молекулы образуют переходное состояние (активированный комплекс), которое затем, распадаясь, дает продукты реакции. При этом энергия, заимствованная для образования активированного комплекса, частично, полностью или с избытком возвращается в виде избытка свободной энергии ΔG. Так, например, энергия активации, необходимая для достижения переходного состояния при распаде перекиси водорода:

2H2O2→2H2O+O2 равна 18 ккал/моль. В присутствии обычного химического катализатора – платины эта энергия снижается до 12 ккал/моль. Специфический же фермент, каталаза, снижает энергию активации до 5 ккал/моль. Таким образом, роль обычного химического катализатора и веще большей степени фермента состоит в том, что он снижает энергию активации и значительно увеличивает вероятность достижения данной молекулой переходного состояния. Другим примером может служить процесс гидролиза белков, энергия активации для которого в присутствии HCl равна 20 ккал/моль, а в присутствии трипсина она составляет только 12 ккал/моль.

Воздействие на равновесные состояния

Мы уже упоминали, что ферменты мало влияют на конечное состояние равновесия реакции. Это очень важный момент, поскольку большинство реакций, протекающих в клетках, обратимо. Такова, например, реакция гидролиза сложного эфира:

R−COOR′+H2O R−COOH+R′OH эфир кислота спирт

(20%) (80%)

Регуляция действия ферментов

Скорости химических реакций, составляющих метаболизм, изменяются (регулируются) в зависимости от условий среды и физиологического состояния. Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Существует несколько способов такой регуляции.

Аллостерическая регуляция. Многие ферменты могут обратимо связывать определенные метаболиты, ингибирующие или активирующие фермент. Такие метаболиты называют эффекторами.

Эффектор присоединяется не к каталитическому активному центру фермента, а к специальному регуляторному центру, который называют также аллостерическим центром («в другом месте расположенный центр»). Аллостерические ферменты построены, как правило, из двух и большего числа субъединиц. Одна субъединица имеет каталитический центр (каталитическая субъединица), другая – регуляторный центр (регуляторная субъединица). В отсутствие аллостерического ингибитора субстрат присоединяется к каталитически активному центру и происходит реакция. Если в среде есть аллостерический ингибитор, он присоединяется к регуляторному центру, что ведет к изменению конформации регуляторной субъединицы; вследствие этого изменяется конформация и каталитической субъединицы, в том числе каталитического активного центра. В результате активность фермента снижается. Чем выше концентрация аллостерического ингибитора, тем больше молекул фермента блокируется им и тем меньше скорость превращения субстрата. Аналогично происходит и активация ферментов при действии аллостерических активаторов.

Рассмотрим в качестве примера регуляцию синтеза уридинтрифосфата (УТФ). По строению УТФ сходен с АТФ.

Метаболический путь синтеза УТФ включает восемь реакций. Первая реакция катализируется ферментом карбамоилфосфатсинтетазой II. Продукт реакции – карбамоилфосфат – образуется из диоксида углерода, амидной группы глутамина и фосфатного остатка АТФ; АТФ служит также источником энергии. Карбамоилфосфатсинтетаза II – это аллостерический фермент: конечный продукт метаболического пути – УТФ – является его аллостерическим ингибитором. Чем больше концентрация УТФ, тем меньше скорость первой реакции, а значит, и всех остальных реакций, поскольку для них образуется мало субстратов. Таким способом скорость синтеза УТФ уравнивается со скоростью его расходования, т. е. с потребностью клетки в этом веществе. Здесь мы имеем дело с регуляцией по механизму отрицательной обратной связи.

В приведенном примере регуляция действия фермента осуществляется эффектором, по химической природе отличающимся об субстрат: это гетеротропные аллотерические ингибиторы и активаторы. Если фермент построен из идентичных протомеров, т. е. каждый протомер имеет каталитический активный центр, то аллостерическая регуляция может осуществляться самим субстратом: присоединение субстрата к одному протомеру изменяет конформацию всего белка, и активность других протомеров может изменяться (гомотропная аллостерическая регуляция).

Аллостерические механизмы регуляции характерны не только для ферментов, но и для белков, выполняющих другие функции. Например, транспорт кислорода гемоглобином регулируется по механизму гомотропной аллостерической активации: молекула кислорода, присоединившаяся к одному протомеру, увеличивает сродство к кислороду других протомеров.

Более сложным механизмом аллостерической регуляции контролируется синтез циклоаденозинмонофосфата (3',5'–циклоАМФ, или цАМФ):

Циклоаденозинмонофосфат образуется из АТФ при действии аденинлатциклазы:

АТФ→цАМФ+Н4Р2О7

Эффекторами аденилатциклазы служат некоторые гормоны (адреналин, глюкагон и ряд других). В регуляции участвуют еще два белка – рецептор гормона и ГТФ-связывающий белок; эти белки можно рассматривать как субъединицы аденилатциклазы. Все три субъединицы локализованы в плазматической мембране. Рецептор гормона ориентирован центром связывания на наружную поверхность мембраны, и к нему может присоединяться гормон из межклеточной жидкости. Каталитическая субъединица (собственно аденилатциклаза) своим активным центром выходит на внутреннюю поверхность мембраны. Когда рецептор гормона свободен, ГТФ-связывающий белок соединен с ГДФ; в этом состоянии системы аденилатциклаза неактивна. Если к рецептору присоединяется гормон, ГДФ в ГТФ-связывающем белке заменяется на ГТФ, и этот новый комплекс активирует аденилатциклазу – начинается синтез цАМФ.

В присутствии гормона ГТФ-связывающий белок и сам активируется – начинает с небольшой скоростью гидролизировать ГТФ на ГДФ и Н3РО4. При этом образуется комплекс с ГДФ, который не активирует аденилатциклазу, но если рецептор по-прежнему соединен с гормоном, то ГДФ в комплексе снова заменяется на ГТФ и аденилатциклаза активируется. Изменения активности аденилатциклазы происходят в результате конформационных перестроек всех трех белков, вызываемых присоединением гормона.

Регуляция белковыми ингибиторами. Одним из важных примеров регуляции белковыми ингибиторами является регуляция протеинкиназ – ферментов, фосфорилирующих белки. Проиеинкиназа в активном центре представляет собой белок, построенный из одной пептидной цепи (субъединица С). В клетке имеется белок (субъединица R), способный соединяться с белком С, причем образуя тетрамерный комплекс R2С2. Этот комплекс не обладает ферментативной активностью. Активация фермента происходит при участии цАМФ. На поверхности субъединицы R есть центр связывания цАМФ: после соединения цАМФ изменяется конформация белка, и сродство субъединицы R к субъединице С уменьшается – происходит диссоциация комплекса:

R2С2+2цАМФR2цАМФ2+2С

Поскольку этот процесс обратимый, повышение концентрации цАМФ в клетке ведет к активации протеинкиназ, а снижение – к ингибированию.

Широко распространены белковые ингибиторы протеолитических ферментов. Функция этих ингибиторов – предотвращение несвоевременного разрушения белков в тканях и жидкостях организма. В частности, в плазме крови белковые ингибиторы протеиназ участвуют в регуляции таких процессов, как образование и разрушение физиологически активных пептидов, свертывание крови, растворение кровяных сгустков.

Механизм действия белковых эффекторов может быть связан с измерением конформации фермента, как и при аллостерической регуляции метаболитами.

Регуляция ферментов путем их фосфорилирования – дефосфорилирофания. Протеинкиназы катализируют фосфорилирование белков. Если фосфорилируемые белки – это тоже ферменты, то их активность в результате фосфорилирования в одних случаях уменьшается, в других увеличивается. Например, в клетках живой ткани есть липаза, существующая в двух формах – фосфопротеина и простого белка. Эти формы могут превращаться друг в друга. Фосфопротеин образуется в результате действия протеинкиназы:

Липаза+АТФ→Липаза*ОРО3Н2+АДФ

Фосфорилированная липаза может вновь превращаться в простой белок при действии фосфопротеинфосфатазы – фермента, гидролитически отщепляющего фосфорную кислоту от фосфопротеинов:

Липаза*ОРО3Н2+ Н2О→Липаза+Н3РО4

Фосфорилированная липаза обладает значительно более высокой активностью, чем нефосфорилированная.

Протеинкиназы – это группа ферментов, различающихся специфичностью: разные протеинкиназы фосфорилируют разные белки. Такой механизм регулирует активность многих ферментов.

Аденилатциклазная система. Аденилатциклаза и протеинкиназы образуют единую регуляторную систему (каскад реакций), служащую для передачи физиологического сигнала из внеклеточной среды внутрь клетки. Первым вестником сигнала чаще всего служат некоторые гормоны, активирующие аденилатциклазу. В результате образуется цАМФ – второй (внутриклеточный) вестник сигнала; цАМФ активирует протеинкиназы, протеинкиназы фосфорилируют некоторые ферменты, изменяя их активность. Таким путем гормон, не проникая в клетку, изменяет ее метаболизм.

Активация частичным протеолизом. Многие ферменты образуются из неактивных белков (проферментов) в результате отщепления части пептидной цепи. Например, пищеварительный протеолитический фермент трипсин образуется из профермента трипсиногена. Трипсиноген синтезируется в клетках поджелудочной железы и секретируется в панкреатический сок, который выводится в двенадцатиперстную кишку. Клетки кишечника выделяют протеолитический фермент энтеропептидазу, который отщепляет гексапепид с N-конца молекулы трипсиногена:

ТрипсиногенТрипсин+Гексапептид

(229 аминокислотных (223 аминокис остатков) лотных остатка)

В результате отщепления части пептидной цепи происходит перестройка пространственной структуры и формируется активный центр, т. е. неактивный предшественник превращается в фермент трипсин.

В некоторых случаях функционируют целые каскады последовательных реакций частичного протеолиза, когда активированный предыдущий фермент в свою очередь активирует следующий, и т. д. Например, свертывание крови происходит в результате каскада реакций активации серии ферментов, последний из которых превращает растворимый белок плазмы крови фибриноген в нерастворимый белок фибрин.

Механизм активации путем частичного протеолиза наиболее характерен для протеолитических ферментов (пептидогидролаз). Это связано с тем, что белки, являющиеся субстратами пептидогидролаз, составляют основу структурно-функционального аппарата клетки; нерегулируемое действие пептидогидролаз могло бы быть опасным для клетки. Поэтому в ходе эволюции выработался механизм, заключающийся в том, что протеолитические ферменты образуются и хранятся в неактивной и безопасной форме проферментов и активируются в нужный момент.

Ингибиторы ферментов

Ингибиторами ферментов называют вещества, снижающие их активность. Наибольший интерес представляют ингибиторы, взаимодействующие с активным центром фермента. Такие ингибиторы чаще всего являются структурными аналогами субстрата, и, следовательно, комплементарны активному центру фермента. Поэтому они подавляют активность только одного фермента или группы ферментов с очень сходным устройством активного центра. Различают ингибиторы конкурентные и неконкурентные, обратимые и необратимые.

Малоновая кислота НООС-СН2-СООН является структурным аналогом янтарной кислоты, поэтому она может присоединяться к активному центру сукцинатдегидрогеназы. Но дегидрирование малоновой кислоты невозможно. Если в реакционной смеси имеются одновременно и янтарная, и малоновая кислоты, то происходят следующие процессы:

E+SЕSЕ+Р

Некоторые молекулы фермента оказываются занятыми ингибитором (I) и не участвуют в реакции превращения субстрата: следовательно, скорость образования продукта снижается. Если повышать концентрацию субстрата, то доля комплекса ЕS увеличивается, а комплекса EI уменьшается: субстрат и ингибитор конкурируют за активный центр фермента. Это пример конкурентного ингибирования. При достаточно высокой концентрации субстрата весь фермент будет в форме комплекса ЕS и скорость реакции будет максимальной, несмотря на присутствие ингибитора.

Некоторые ингибиторы образуют комплекс не со свободными ферментом, а с фермент-субстратным комплексом:

ЕS+IЕSI

В этом случае повышение концентрации субстрата не уменьшает действие ингибитора: такие ингибиторы называются неконкурентными.

В некоторых случаях ингибитор может подвергаться химическому превращению под действием фермента. Например, n-нитрофенилацетат гидролизируется протеолитическим ферментом химотрипсином; гидролиз происходит в две стадии:

Сначала ацетильный остаток присоединяется к гидроксильной группе остатка серина в активном центре фермента (реакция а), а затем происходит гидролиз ацетил-фермента (реакция б). Первая стадия протекает быстро, а вторая очень медленно, поэтому даже при небольших концентрациях n-нитрофенилацетата значительная часть молекул фермента находится в ацетилированной форме, и скорость гидролиза природного субстрата (пептидов) снижается. Такие ингибиторы называются псевдосубстратами или плохими субстратами.

Иногда химическое превращение ингибитора в активном центре приводит к образованию продукта, который не может отделиться от субстрата: это необратимое ингибирование, или инактивация. Например, 3-хлорацетолфосфат необратимо ингибирует триозофосфатизомеразу. Этот ингибитор является структурным аналогом диоксиаценонфосфата и необратимо присоединяется к остатку глутаминовой кислоты в активном центре фермента:

Ингибиторами могут быть не только аналоги субстратов, но и аналоги коферментов, способные занимать место настоящего кофермента, но неспособные выполнять его функцию.

Взаимодействие фермента с ингибитором часто в такой же мере специфично, как и взаимодействие с субстратом или коферментом. На этом основано применение ингибиторов для избирательного подавления активности того или иного фермента в сложной ферментативной реакции или в организме. В частности, многие лекарственные вещества являются ингибиторами ферментов.

Есть ингибиторы, действующие менее избирательно. Например, n-хлормеркурибензонат является специфическим реагентом на сульфгидрильные группы в белках:

Поэтому n-хлормеркурибензонат ингибирует все ферменты, которые имеют SH-группы, участвующие в катализе.

Другим примером может служить ингибирование диизопропилфторфосфатом пептидгидролиз и эстераз, имеющих серин в активном центре. Ингибитор необратимо присоединяется к остатку серина:

Остатки серина вне активного центра при этом остаются незатронутыми. Диизопропилфторфосфат – представитель группы фосфорорганических соединений, обладающих чрезвычайно высокой токсичностью. Токсическое действие обусловлено именно ингибированием ферментов, и прежде всего ацетилхолинэстеразы.

Ингибиторы – очень эффективные инструменты для исследования строения активного центра ферментов и механизма катализа. Ингибиторы, необратимо присоединяющиеся к активному центру фермента, «метят» активный центр: если теперь фермент гидролизировать, то одна из аминокислот в гидролизате остается связанной с ингибитором. Таким способом узнают, какие аминокислоты и функциональные группы формируют активный центр.

Температуры и ферментативная реакция

Влияние температуры на скорость реакции

Повышение температуры увеличивает подвижность молекул, а вследствие этого и скорость химических реакций. Как правило, скорость реакции быстро возрастает по мере повышения температуры. Это справедливо и для реакций, катализируемых ферментами, однако при достаточно высоких температурах ферменты, как и все белки, могут денатурировать. Компромисс между двояким влиянием повышения температуры, а именно возрастанием скорости реакции из-за увеличения подвижности молекул и ее замедлением, обусловленным денатурацией фермента, приводит к тому, что для каждой конкретной реакции имеется некая оптимальная температура. Поскольку вероятность денатурации зависит не только от температуры, но также от pH и от продолжительности ферментативной реакции, точное значение оптимальной температуры заранее предсказать обычно нельзя.

Термическая инактивация ферментов

Иногда термическую активацию используют для характеристики фермента. Термическая инактивация – это денатурация фермента под действием тепла, проявляющаяся в снижении ферментативной активности. Относительная величина инактивации при данной температуре экспоненциально зависит от времени нагревания. Очевидно, что при этом речь идет о температурах, заметно более высоких по сравнению с оптимальной.

Иногда термическую активацию используют для характеристики фермента. Термическая инактивация – это денатурация фермента под действием тепла, проявляющаяся в снижении ферментативной активности. Относительная величина инактивации при данной температуре экспоненциально зависит от времени нагревания. Очевидно, что при этом речь идет о температурах, заметно более высоких по сравнению с оптимальной.

Если Е означает остаточную активность фермента после прогревания в течение времени t (измеренную при оптимальной температуре), а Е0 – активность нативного фермента, то

Е=Е0е-Kt, где K – константа инактивации, а t – продолжительность прогревание.

Отсюда: ln - Kt

В полулогарифмических координатах относительная величина остаточной ферментативной активности при данной температуре линейно зависит от продолжительности нагревания. Инактивация проявляется только при превышении определенной температуры.

Возможность использования явления термической инактивации может быть проиллюстрирована следующим примером. Пусть биологический препарат обладает двумя видами ферментативной активности по отношению к двум различным субстратам. Желательно знать, свидетельствует ли это о наличии в препарате двух разных ферментов или только одного, но имеющего двоякую специфичность. Строят кривые термической инактивации, измеряя в каждой точке обе ферментативные активности. Если законы изменения этих активностей точно совпадают, есть основания думать, что имеют дело с одним ферментом. Если же нет, то, вероятно, что обе эти реакции катализируются двумя разными ферментами. При этом не следует забывать, что субстрат оказывает защитное воздействие на фермент.

Влияние рН на ферментативную активность

Ферментативные реакции очень чувствительны к pH среды. Это связано с тремя факторами.

При экстремальных значениях pH необратимо изменяется структура фермента, поскольку в этих условиях может происходить денатурация белка, а в некоторых случаях и изменение характера связи между апоферментом и коферментом.

Изменение pH в большинстве случаев нарушает характер ионизации субстрата.

Величина pH оказывает влияние на характер взаимодействия фермент – субстрат и на сам катализ, что связано, в частности, с изменением степени диссоциации аминокислотных остатков, входящих в состав активного центра.

Оптимум pH определяют экспериментально для каждого фермента, действующего в определенных условиях на данный субстрат. Кривая зависимости активности фермента от pH может иметь форму колокола или сигмоидную форму с выходом на плато. При экстремальных значениях pH ферментативная активность резко снижается вследствие денатурации белка.

Зависимость скорости реакции от времени

Определим понятие порядка химической реакции независимо от того, протекает ли реакция в присутствии фермента или в его отсутствие.

Реакциями нулевого порядка называют такие реакции, в которых количество субстрата, преобразуемое за единицу времени, остается постоянным независимо от его концентрации. Это значит, что если, например, идет ферментативная реакция и путем отбора проб каждую минуту определяют количество субстрата, то обнаруживается, что содержание субстрата между двумя любыми соседними определениями уменьшается на одну и ту же величину. Таким образом, имеем: где dc обозначает уменьшение количества субстрата в течение интервала времени dt.

Видно, что отношение межу величинами dc и dt при реакции нулевого порядка остается постоянным и равным величине K.

Реакции первого порядка – это такие реакции, в которых количество субстрата, преобразуемое за единицу времени, пропорционально имеющемуся в данный момент количеству субстрата. Например, за каждую минуту преобразуется 1/10 количества субстрата, находящегося в среде. Скорость расходования субстрата здесь не остается неизменной; она пропорциональна концентрации субстрата и, следовательно, непрерывно уменьшается, т. е.

Концентрация субстрата в этом случае экспоненциально снижается во времени.

Реакции первого порядка играют большую роль в физических и биологических явлениях. Так, например, радиоактивный распад представляет собой реакцию первого порядка. Рост популяции бактерий также происходит по экспоненциальному закону, однако в этом случае концентрация не снижается во времени, а возрастает.

Существуют реакции и более высокого порядка, однако их кинетика сложна. Начальную скорость определяют для этих реакций как тангенс угла наклона касательной к кривой изменения концентрации во времени, экстраполированный к нулевому моменту времени.

Зависимость скорости реакции от количества фермента

Ферментативные реакции протекают обычно в условиях избытка субстрата. В этих условиях скорость реакции пропорциональна количеству фермента, находящегося в среде. Эта пропорциональность сохраняется до определенного предела, за которым скорость снижается из-за недостатка субстрата.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

Это наиболее важный аспект. Его исследовали Виктор Анри в 1905 году, затем Михаэлис и Ментен в 1913 году. Оказалось, что скорость реакции не пропорциональна концентрации субстрата. При увеличении концентрации субстрата скорость сначала увеличивается, а затем стремится к некоей постоянной величине. Кривая изменения скорости асимптотически приближается к определенному предельному значению, соответствующему максимальной скорости.

11. Общие правила работы с ферментами

Ферменты – относительно неустойчивые вещества; при неблагоприятных условиях они легко денатурируются и инактивируются. Поэтому в работе с ферментами всегда следует прежде всего заботиться о том, чтобы не допустить их инактивации. Сравнительно жесткие воздействия (сильные кислоты, высокая температура, сильнодействующие реагенты и т. д. ), часто используемые в органической химии, мгновенно разрушают ферменты. Таким образом, воздействия, которыми могут быть подвергнуты ферменты, строго ограничены пределами их стабильности.

Успех при работе с ферментами зависит от соблюдения условий, при которых ферменты остаются стабильными. Эти условия для разных ферментов различны, но всегда следует избегать высоких температур, а так же растворов с выраженной кислотной или щелочной реакцией. Рекомендуется (там, где это возможно) не подвергать ферменты воздействию температуры, превышающей температуру тела. В настоящее время при очистке многих ферментов поддерживают температуру 00С как само собой разумеющиеся условие. Использование для этой цели бани с охлажденным спиртом предпочтительнее, чем работа в холодной комнате, не только потому, что при этом создаются более комфортабельные условия для работающего, но также и потому, что сосуд с жидкостью, погруженный в подобную баню, охлаждается очень быстро, в то время как в холодной комнате, будучи окружен плохо проводящим тепло воздухом, он охлаждается относительно медленно. Для работы при 00С сосуды из нержавеющей стали (вследствие их высокой теплопроводности) предпочитают стеклянным.

Большинство ферментов инактивируются в растворах с рН<5 или >9, хотя из этого правила имеются исключения. Поэтому важно, чтобы при доведении рН раствора фермента до определенного значения путем добавления кислоты или щелочи вокруг каждой капли добавляемого к раствору реагента не возникало зоны деструкции. Реагент следует добавлять медленно, давая ему стекать по стенке сосуда, и одновременно энергично перемешивать раствор, желательно с помощью механической мешалки. Добавление реагента следует производить, если это возможно, при 00С.

Многие ферменты подвергаются денатурации на поверхностях раздела. Поэтому важно избегать образования пены – переливать раствор фермента из одного сосуда в другой следует по стенке сосуда. По той же причине не следует употреблять мешалки, вспенивающие поверхность жидкость. Лопасти мешалки должны быть глубоко погружены, и поток жидкости должен быть относительно спокойным. Иногда возникают трудности при фракционировании сульфатом аммония, если соль добавляется в сухом виде, так как при этом растворенный в жидкости воздух «высаливается» в виде мелких пузырьков и вызывает денатурацию фермента. Это затруднение встречается редко, но если оно имеет место, то его можно преодолеть, добавляя соль в виде насыщенного раствора.

Органические растворители, например спирт, инактивируют большинство ферментов при комнатной температуре, если только они не применяются в достаточно низких концентрациях. Поэтому фракционное осаждение ферментов спиртом или ацетоном необходимо проводить при возможно более низкой температуре, следя за тем, чтобы раствор не нагревался в результате выделения тепла при смешивании растворителя с водой. Ни одной из полученных фракций нельзя давать нагреваться даже на несколько градусов, пока растворитель не будет удален или пока в результате разведения концентрация его не станет безопасной.

Отделение осадков путем центрифугирования обычно предпочитают фильтрованию, и центрифуга с охлаждением – незаменимый предмет лабораторного оборудования.

Во многих случаях даже при наиболее благоприятных условиях наблюдается медленное инактивирование фермента при стоянии. Поэтому рекомендуется проводить очистку фермента по возможности быстро, заканчивая выделения в течение 2 – 3 дней, если только фермент не является достаточно устойчивым.

III. Практическая часть

1. Каталаза. ее строение и свойства

Каталаза является ферментом, неизменно присутствующим в аэробных клетках; иногда ее количество может достигать 1% от сухого веса бактерий. Этот фермент катализирует распад Н2О2 на воду и кислород. Постулируемый механизм в основных чертах совпадает с механизмом действия пероксидаз. Если в уравнение

Н2О2+АН2→2Н2О+А вместо АН2 подставить Н2О2, а вместо А – О2. то получим

2Н2О22Н2О+ О2.

Каталаза функционирует очень быстро, почти в 104 раз быстрее пероксидаз. Молекулярная активность (на каталитический центр) составляет примерно 2*105 с-1.

Каталаза, согласно существующим представлениям, выполняет защитные функции, препятствуя накоплению Н2О2, оказывающей повреждающее действие на клеточные компоненты. Гибельное действие О2 на облигатные анаэробы, возможно, объясняется отсутствием у них этого фермента. В пользу такого представления говорит существование наследственной болезни акаталаземии. Люди с очень низкой активностью каталазы встречаются во многих местах, но особенно их много в Корее. По имеющимся оценкам, в Японии насчитывается 1800 человек, лишенных каталазы. Поскольку примерно у половины этих людей не наблюдается никаких симптомов, каталазу можно было бы отнести к несущественным ферментам. Однако у многих лиц вокруг зубов развиваются язвенные процессы, которые могут приводить к серьезным осложнениям. По-видимому, перекись водорода, вырабатываемая бактериями, по мере накопления окисляет гемоглобин в метгемоглобин, лишая пораженные ткани кислорода.

Каталаза имеет молекулярную массу около 250000, под действием кислот и щелочей может диссоциировать на более мелкие субмолекулы. Исследования кристаллической каталазы с помощью электронного микроскопа (наряду с анализом ее химических и физических характеристик) показали, что в молекуле ее шесть субмолекул. каждая субмолекула содержит по три полипептидных цепочки с молекулярной массой 14000 состоящих из 120 аминокислотных остатков.

Каталаза широко распространена в тканях, а также в эритроцитах, она один из наиболее активных ферментов, оптимум рН 7,6.

Каталазная активность наблюдается почти во всех животных клетках и органах. Печень, эритроциты и почки – богатые источники каталаз. Эта активность также обнаруживается во всех растительных материалах и в большинстве микроорганизмов. В каждом случае каталаза, вероятно, предотвращает аккумуляцию вредного Н2О2, образуемого при аэробном окислении.

Каталаза из печени быка (М=248000) содержит 4 гемовых группы на молекулу фермента. Ее субъединицы лишены ферментативной активности. Одна молекулы каталазы может разложить 44000 молекулы Н2О2 в секунду. Фактически фермент не требует почти никакой энергии активации и скорость реакции, по-видимому, полностью определяется диффузией. Каталаза реагирует с Н2О2 с образованием относительно стабильного фермент-субстратного комплекса. Каталазную реакцию можно записать следующим образом:

НО НО О

+2 Н2О+

НО НО О

Несмотря на интенсивное изучение каталазы, ее роль в биологическом окислении еще не вполне ясна. Поскольку каталазы обнаружены в микротельцах (пероксисомах), предполагается, что их функция состоит в разрушении перекиси водорода, образующихся в этих структурах.

2. Влияние различных факторов на активность каталазы

Опыт№1. Зависимость активности каталазы от рН

1. В пробирку№1 нальем 1 мл воды, а в пробирку№2 – 1 мл щелочи (NaOH), в пробирку №3 – 1 мл кислоты (HCl)

2. Определим активную кислотность (рН) среды с помощью универсальной индикаторной бумаги. В пробирке№1 рН=7 (нейтральная среда), а в пробирке №2 – рН=9 (щелочная среда), рН=3 (кислая среда).

Пробирка№ 1 Пробирка№ 2 Пробирка №3

Время 30 мин. 4ч. 30 мин. 5 ч.

3. Вывод: в нейтральной среде реакция идет интенсивнее, т. е. проявляется зависимость активности фермента от рН среды.

Опыт№2. Зависимость активности каталазы от температуры.

1. Нальем в три пробирки по 5мл Н2О2 и 1 мл картофельного сока, содержащего каталазу.

2. Поместим эти пробирки в водяные бани с температурой 200С,400С и 800С.

3. Наблюдаем за временем и интенсивностью протекания реакции. Окончание реакции – прекращение выделения пузырьков газа.

Пробирка№1 Пробирка№2 Пробирка№3

Температура 200 400 800

Время 24 мин. 16 сек. 7 мин. 4 сек. 10 мин. 30 сек.

Интенсивность Интенсивность реакции невелика Интенсивная реакция Реакция практически не идет

4. Вывод: Как и при реакциях неорганических веществ, мы здесь наблюдаем повышение скорости реакции с повышением температуры (пробирка№1,№2), но это возможно здесь лишь до определенного предела. С повышением температуры выше 400 С начинается замедление реакции. Это связано с белковой природой фермента (с повышение температуры начинается процесс денатурации).

Опыт№3. Зависимость активности каталазы от концентрации.

1. К 5мл Н2О2 добавляем в пробирку№1 – концентрированный сок картофеля; в пробирку№2 – разбавленный в 5 раз сок картофеля.

2. Наблюдаем в пробирке№1 бурную реакцию (30 сек. ), выделение газа; а в пробирке№2 газ почти не выделяется, реакция идет менее интенсивно (2 мин. )

3. Вывод: С повышением концентрации каталазы скорость реакции увеличивается.

Опыт№4. Зависимость активности каталазы от концентрации субстрата.

1. В пробирку №1 нальем 1 мл Н2О2 - 33% и 1 мл сока картофеля; в пробирку №2 нальем 1 мл Н2О2 - 3% и 1 мл сока картофеля.

2. Наблюдаем за интенсивность протекания реакции. В пробирке№1 пенообразование и выделение пузырьков, идет быстрее, чем в пробирке №2.

3. Вывод: Чем выше концентрация субстрата, тем активнее идет реакция.

IV. Вывод

Учение о ферментах традиционно занимает ведущее место в биохимии, а ферменты являются наиболее изученным классом белков. Это объясняется той важной ролью, которую играют ферменты: любые химические превращения веществ в организме происходят при их участии. Однако есть и другая причина особого внимания к ферментам, не связанная с их биологической ролью. Дело в том, что ферменты в отличие от большинства других белков сравнительно легко обнаруживать и измерять их количество по катализируемой ими реакции. Многие свойства, характерные для всех белков, вначале были изучены на ферментах. Такие понятие как активный центр, ингибиторы, изоферменты (изобелки), аллостерическая регуляция, возникли и сложились в энзимологии, и лишь позднее распространились на другие белки.

Огромное значение имеет изучение ферментов для развития и углубления знаний о процессах катализа – процесса, заключающегося в изменении скорости химических реакций в присутствии веществ, называемых катализаторами.

Сегодня мы знаем, что ферменты – это особая группа катализаторов, которая изучается особенно активно в настоящее время. Рассматривается влияние катализаторов на различные процессы и идет поиск путей применения этих знаний, изучаются условия, влияющие на ферменты. Небольшая попытка показать влияние факторов среды на активность фермента каталазы содержится в практической части работы, и она подтверждает известные теоретические положения о особых свойствах ферментов и условиях их активности.

Каталаза является ферментом, неизменно присутствующим в аэробных клетках; иногда ее количество может достигать 1% от сухого веса бактерий. Этот фермент катализирует распад Н2О2 на воду и кислород. Постулируемый механизм в основных чертах совпадает с механизмом действия пероксидаз. Если в уравнение

Н2О2+АН2→2Н2О+А вместо АН2 подставить Н2О2, а вместо А – О2. то получим

2Н2О22Н2О+ О2.

Несмотря на интенсивное изучение каталазы, ее роль в биологическом окислении еще не вполне ясна. , поэтому дальнейшее изучение этого фермента представляет интерес для исследований, как впрочем и энзимология в целом.

Комментарии


Войти или Зарегистрироваться (чтобы оставлять отзывы)