Исследование биосенсорных возможностей уреазы

В 1926 году американский биохимик Джеймс Самнер впервые выделил уреазу и доказал ее белковую природу. По современной классификации ферментов уреаза (карбамид-амидогидролаза) - сложный фермент, относящийся к классу гидролаз. Уреаза катализирует реакцию гидролиза мочевины уреаза

(NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2

Активный центр уреазы состоит из полипептидной цепи с уникальной комбинацией аминокислотных остатков цистеина HS - CH2 - CH - (NH2) - COOH и гистидина С6Н9N3O2 . Кофактором является ион двухвалентного никеля Ni[2+].

Самое сложное строение имеет уреаза, выделенная у Helicobacterpylori. Если у большинства выделенных растительных уреаз четвертичная структура состоит из двух субъединиц, соединенных в димеры, которые, в свою очередь, соединяются друг с другом в триммеры, то уреаза Helicobacterpylori имеет самое сложное строение: 4 из 6 обычных субъединиц фермента объединены в общий комплекс из 24 субъединиц. Относительная молекулярная масса уреазы представленная в литературе различна и зависит от растительного источника, из которого она выделена.

Уреаза из бобов (Jack bean) имеет относительную молярную массу около 550 тыс.

Уреаза как любой фермент характеризуется ферментативной активностью , термолобильностью, оптимальная температура 60°С , зависимостью от рН среды, которая лежит в пределах физиологических значений рН - 6,5 - 7,5, зависимостью от рН среды, которая лежит в пределах физиологических значений рН - 6,5 - 7,5, специфичностью:

(NH2) - C(O) - NH2 + H2O 2 NH3 ↑ + CO2↑

Уреаза обнаружена в клетках бактерий, дрожжей, семенах кабачка, бобов сои, а также у ряда позвоночных. Уреаза отсутствует у животных, у которых в качестве основного продукта обмена азота образуется мочевина. В организме человека и животных уреаза образуется болезнетворной бактериальной флорой желудочно - кишечного тракта и мочевыводящих путей.

Сведения о токсических веществах.

Свинец.

В настоящее время ионы свинца Pb [2+] занимает первое место среди причин промышленных отравлений. Это вызвано широким применением его в различных отраслях промышленности. Воздействию свинца подвергаются рабочие, добывающие свинцовую руду, на свинцово-плавильных заводах, в производстве аккумуляторов, при пайке, в типографиях, при изготовлении хрустального стекла или керамических изделий, этилированного бензина, свинцовых красок и др. Загрязнение свинцом атмосферного воздуха, почвы и воды в окрестности таких производств, а также вблизи крупных автомобильных дорог создает угрозу поражения свинцом населения, проживающего в этих районах, и прежде всего детей, которые более чувствительны к воздействию тяжелых металлов.

Отравление свинцом (сатурнизм) представляет собой пример наиболее частого заболевания, обусловленного воздействием окружающей среды. В большинстве случаев речь идет о поглощении малых доз и накоплении их в организме, пока его концентрация не достигнет критического уровня необходимого для токсического проявления. Острые свинцовые отравления встречаются редко. Их симптомы - слюнотечение, рвота, кишечные колики, острая форма отказа почек, поражение мозга. В тяжёлых случаях -смерть через несколько дней. Ранние симптомы отравления свинцом проявляются в виде повышенной возбудимости, депрессии и раздражительности. При отравлении органическими соединениями свинца его повышенное содержание обнаруживают в крови.

Существует острая и хроническая форма болезни. Острая форма возникает при попадании значительных его доз через желудочно-кишечный тракт или при вдыхании паров свинца, или при распылении свинцовых красок. Хроническое отравление наиболее часто возникает у детей, лижущих поверхность предметов, окрашенных свинцовой краской. Дети в отличие от взрослых гораздо легче абсорбируют свинец. Хроническое отравление может развиваться при использовании плохо обожженной керамической посуды, покрытой эмалью, содержащей свинец, при употреблении зараженной воды, особенно в старых домах, где канализационные трубы содержат свинец, при злоупотреблении алкоголем, изготовленным в перегонном аппарате, содержащим свинец.

Попадая оральным путем, свинец абсорбируется в кишечнике и достигает печени, откуда с желчью вновь попадает в 12-ти перстную кишку. Одна часть свинца реабсорбируется, другая удаляется с испражнениями. Если свинец попадает через дыхательные пути, он быстро достигает кровотока и тогда его действие максимально. Из крови свинец экскретируется почками, часть его депонируется в костях. Свинец ингибирует действие многих энзимов, а также инкорпорацию железа в организме, в результате чего в моче резко увеличивается количество свободного протопорфирина. Его увеличение в моче является четким клиническим признаком сатурнизма.

Органами-мишенями при отравлении свинцом являются кроветворная и нервная системы, почки. Менее значительный ущерб сатурнизм наносит желудочно-кишечному тракту. Один из основных признаков болезни - анемия, возникающая в результате усиленного гемолиза. На уровне нервной системы отмечается поражение головного мозга и периферических нервов. Сатурнизм - обусловленная энцефалопатия чаще наблюдается у детей, реже - у взрослых. В головном мозге выражен диффузный отек серого и белого вещества в сочетании с дистрофическими изменениями кортикальных и ганглионарных нейронов, демиэлинизация белого вещества. В капиллярах и артериолах отмечается пролиферация эндотелиоцитов. Мозговые поражения клинически сопровождаются конвульсиями и бредом, иногда приводят к сонливости и коме. Из периферических нервов чаще всего поражаются наиболее "активные" двигательные нервы мышц. Морфологически наблюдается их демиэлинизация с последующим повреждением осевых цилиндров. Тяжелее всего страдают мышцы - разгибатели кисти, которая приобретает вид "рогов оленя". Паралич m. peroneus приводит к положению "согнутой ноги".

Свинец является металлом, оказывающим хорошо известное нейротоксическое воздействие. Нарушение процесса развития нервной системы детей является наиболее важным воздействием свинца. Эти нарушения могут объясняться его воздействием на эмбрионы, а также в период грудного вскармливания и в раннем детском возрасте.

Свинец накапливается в скелете, и его поступление из костей в период беременности и грудного кормления вызывает воздействие на эмбрионы и детей, вскармливаемых грудью. В этой связи важное значение имеет воздействие свинца на организм женщин до беременности.

Источники проникновения свинца в окружающую среду организм человека.

Пища является доминирующим источником поступления свинца в организм человека во всех группах населения. Важным источником поступления свинца в организм младенцев и детей младшего возраста может быть также попадание в организм через их руки, пищу, содержащую частицы загрязненной почвы, пыли и свинцовой (старой) краски. При использовании водопроводных систем со свинцовыми трубами поступление свинца в организм через питьевую воду может быть также важным источником, в особенности для детей. Воздействие свинца в результате вдыхания может быть также значительным в тех случаях, когда концентрации свинца в окружающем воздухе являются высокими.

В последние десятилетия концентрации свинца в окружающем воздухе сократились: в период 1990-2003 годов уровни содержания свинца в воздухе сократились на 50-70% в Европе. Аналогичным образом сократились уровни атмосферного осаждения.

Свинец, содержащийся в земной коре, может вымываться под воздействием атмосферных процессов, переходя постепенно в океаны. Ионы Рb[2+] довольно нестабильны, и содержание свинца в ионной форме составляет всего 10[-8] %. Однако он накапливается в океанских осадках в виде сульфитов или сульфатов. В пресной воде содержание свинца гораздо выше и может достигать 2 х 10 [-6] %, а в почве примерно такое же количество, что и в земной коре (1,5 х 10 [-3] %) из-за нестабильности этого элемента в геохимическом цикле.

Ежегодно в мире в результате воздействия атмосферных процессов мигрирует около 180 тыс. т свинца. При добыче и переработке свинцовых руд теряется более 20 % свинца. Даже на этих стадиях выделение свинца в среду обитания равно его количеству, попадающему в окружающую среду в результате воздействия на магматические породы атмосферных процессов.

Наиболее серьезным источником загрязнения среды обитания организмов свинцом являются выхлопы автомобильных двигателей. Антидетонатор тетраметил - или тетраэтилсвинец - добавляют к большинству бензинов, начиная с 1923 г. , в количестве около 80 мг/л. При движении автомобиля от 25 до 75 % этого свинца в зависимости от условий движения выбрасывается в атмосферу. Основная его масса осаждается на землю, но и в воздухе остается заметная ее часть.

Свинцовая пыль не только покрывает обочины шоссейных дорог и почву внутри и вокруг промышленных городов, она найдена и во льду Северной Гренландии, причем в 1756 г. содержание свинца во льду составляло 20 мкг/т, в 1860 г. уже 50 мкг/т, а в 1965 г. 210мкг/т.

Активными источниками загрязнения свинцом являются электростанции и бытовые печи, работающие на угле. Источниками загрязнения свинцом в быту могут быть глиняная посуда, покрытая глазурью, т. к. свинец содержится в красящих пигментах.

Свинец не является жизненно необходимым химическим элементом. Он токсичен и относится ко II классу опасности. Неорганические его соединения нарушают обмен веществ и являются ингибиторами ферментов (подобно большинству тяжелых металлов). Биологический период полураспада свинца в костях - около 10 лет. Количество свинца, накопленного в костях, с возрастом увеличивается, и в 30-40 лет у лиц, по роду занятий не связанных с загрязнением свинца, составляет 80-200 мг. Органические соединение свинца считаются ещё более токсичными, чем неорганические.

Вдыхаемая пыль примерно на 30-35 % задерживается в легких, значительная доля её всасывается потоком крови. Всасывания в желудочно-кишечном тракте составляют в целом 5-10 %, у детей - 50 %. Дефицит кальция и витамина D усиливает всасывание свинца. Вследствие глобального загрязнения окружающей среды свинцом он стал вездесущим компонентом любой пищи и кормов. Растительные продукты в целом содержат больше свинца, чем животные.

Кадмий.

Кадмий является наиболее важным металлом при изучении проблемы загрязнений, так он широко распространен в мире и обладает токсичными свойствами. Кадмий, так же как и свинец, обнаружен в основном в сульфидных осадках. В результате атмосферных процессов эти элементы легко попадают в океаны. В почвах содержится приблизительно 4,5x10[-4] %.

Около 1 млн. кг кадмия попадает в атмосферу ежегодно в результате деятельности заводов по его выплавке, что составляет около 45 % общего загрязнения этим элементом. 52% загрязнений попадают в результате сжигания или переработки изделий, содержащих кадмий. Кадмий обладает относительно высокой летучестью, поэтому он легко проникает в атмосферу.

Источники проникновения кадмия в окружающую среду и организм человека.

Попадание кадмия в природные воды происходит в результате применения его в гальванических процессах и техники.

Потенциальным источником загрязнением кадмием являются удобрения. При этом кадмий внедряется в растения, употребляемые человеком в пищу, и в конце цепочки переходят в организм человека. Кадмий и цинк легко проникают в морскую воду и океан через сеть поверхностных и грунтовых вод.

Кадмий накапливается в определённых органах животных (особенно в печени и в почках). Кадмий и его соединения относятся ко II классу опасности. Он проникает в человеческий организм в течение продолжительного периода. Вдыхание воздуха в течение 8 часов при концентрации кадмия 5 мг/м[3] может привести к смерти. При хроническом отравлении кадмием в моче появляется белок, повышается кровяное давление.

При исследовании присутствия кадмия в продуктах питания было выявлено, что выделения человеческого организма редко содержат столько же кадмия, сколько было поглощено. Единого мирового мнения относительно приемлемого безопасного содержания кадмия в пище сейчас нет.

Одним из эффективных путей предотвращения поступления кадмия в виде загрязнений состоит в введении контроля за содержанием этого металла в выбросах плавильных заводов и других промышленных предприятий.

Почки и кости являются целевыми органами, подвергающимися наибольшему воздействию ионов кадмия. В число основных видов критического воздействия входят: а) повышенное содержание белков с низким молекулярным весом в моче в результате повреждения проксимальных тубулярных клеток; б) увеличение опасности остеопороза.

Сообщалось также о повышенной опасности рака легких в результате воздействия через дыхательные пути в ходе осуществления профессиональной деятельности.

Запас безопасности между содержанием кадмия в суточном рационе, который не оказывает какого-либо воздействия, и содержанием, которое может привести к возникновению последствий, является весьма малым, а для групп населения, подверженных высокому уровню воздействия, - практически нулевым. В группы населения, подверженные риску, входят престарелые лица, диабетики и курильщики. Женщины могут быть подвержены более высокой опасности ввиду того, что с учетом более низкого содержания железа в их организмах они поглощают по сравнению с мужчинами более значительные объемы кадмия при одинаковом уровне воздействия.

Пища является основным источником воздействия кадмия на все группы населения (более чем 90% общего объема поступления в организмы некурящих). В сильно-загрязненных районах пыль, содержащаяся в окружающем воздухе, может в значительной степени загрязнять сельскохозяйственные культуры и оказывать воздействие через дыхательные и пищеварительные тракты.

Несмотря на сокращение выбросов кадмия, его концентраций в окружающем воздухе и уровней его осаждения, опубликованные данные не свидетельствуют об уменьшении содержания кадмия в организмах некурящих в течение последнего десятилетия. Результаты исследований баланса кадмия в верхних слоях пахотной почвы свидетельствуют о том, что поступление кадмия по-прежнему превышает его удаление.

Кадмий накапливается в почвах и водосборных бассейнах при определенных условиях состояния окружающей среды и тем самым увеличивает риск будущего воздействия через пищевые продукты.

Фенолы.

Число известных фенольных соединений весьма велико. К настоящему времени их известно несколько тысяч, причем с каждым годом их число растет. Фенольным соединением называется вещество, имеющее в своей молекуле ароматическое (бензольное) кольцо, содержащую одну, две или более гидроксильных групп. Простейшим представителем фенольных соединений является сам фенол:

В зависимости от числа ОН-групп различают одноатомные фенолы (например, вышеприведенные фенол и крезолы) и многоатомные. Среди многоатомных фенолов наиболее распространены двухатомные. Двухатомных фенолов (дигидроксибензолов) существует три соединения: пирокатехин, резорцин, гидрохинон.

По физическим свойствам фенольные соединения принято делить на две группы: - летучие с паром фенолы (фенол, крезолы, ксиленолы, тимол) и нелетучие фенолы (резорцин, пирокатехин, гидрохинон, пирогаллол и другие многоатомные фенолы). Летучие фенолы более токсичны и обладают сильным запахом.

Фенолы и их производные содержатся в древесине, торфе, буром и каменном углях, нефтяных остатках. В живой природе фенолы, главным образом в виде производных, присутствуют в клетках растений флавоноиды, таннины, антоцианы, лигнин, меланины, и др. В свободном состоянии встречаются редко. Можно привести примеры фенол - в иглах и шишках сосны, лишайниках; пирокатехин - в чешуе лука, плодах грейпфрута; флороглюцин - в шишках секвойи, коре яблонь и слив; гидрохинон - в листьях и семенах груши; тимол (3-гидрокси-4-изопропил-толуол) - в листьях тимьяна.

Фенолы образуются в естественных условиях в процессах метаболизма водных организмов, при биохимическом распаде и трансформации органических веществ, протекающих как в водной толще, так и в донных отложениях. Фенольные соединения живых растительных тканей можно считать потенциально токсичными веществами, способными ингибировать рост патогенных грибов или уменьшать скорость размножения вирусов.

Фенол - (оксибензол, устар. карболовая кислота) С6Н5ОН - бесцветные игольчатые кристаллы, розовеющие на воздухе из-за окисления, приводящего к окрашенным продуктам. Обладают специфическим запахом гуаши. Растворим в воде (6 г на 100 г воды), в растворах щелочей, в спирте, в бензоле, в ацетоне, в диэтиловом эфире. 5 % раствор в воде - антисептик, широко применяемый в медицине под названием <<карболка>>.

Легко окисляется по схеме: фенол -> пирокатехин -> 1,2 - бензохинон -> продукты окислительной конденсации

Фенол ядовит. Пыль, пары и раствор фенола вызывают нарушение функций нервной системы, дыхания и кровообращения, раздражает слизистые оболочки дыхательных путей и глаз, вызывает ожоги при попадании на кожу, (предельно допустимые концентрации (ПДК): в воздухе 5мг/м[3], в водоёмах 0,001 мг/л). Попадая в организм, фенол очень быстро всасывается даже через неповрежденные участки кожи и уже через несколько минут начинает воздействовать на ткани головного мозга. Сначала возникает кратковременное возбуждение, а потом и паралич дыхательного центра. Даже при воздействии минимальных доз фенола наблюдается чихание, кашель, головная боль, головокружение, бледность, тошнота, упадок сил. Тяжелые случаи отравления характеризуются бессознательным состоянием, синюхой, затруднением дыхания, нечувствительностью роговицы, скорым, едва ощутимым пульсом, холодным потом, нередко судорогами. Зачастую фенол является причиной онкозаболеваний. В организме фенол легко образует соединения с другими веществами, присутствующими в организме. Чем выше концентрация фенола в крови, тем сильнее его неблагоприятное влияние на здоровье человека. Продукты взаимодействия фенола с другими веществами, а также часть несвязанного фенола выводятся с мочой.

Загрязнение водоемов фенольными соединениями.

Фенолы являются одним из наиболее распространенных загрязнений, поступающих в поверхностные воды со стоками предприятий нефтеперерабатывающей, сланцеперерабатывающей, лесохимической, коксохимической, анилинокрасочной промышленности в результате лесосплава, а также со стоками гидролизной промышленности (переработка непищевого растительного сырья целлюлозно-бумажной и отчасти текстильной промышленности).

В сточных водах промышленных предприятий содержание фенолов может превосходить 5 - 10 г/л при весьма разнообразных сочетаниях, при том, что предельно допустимая концентрация фенолов в питьевой воде и воде рыбохозяйственных водоемов составляет 1 мкг/л. Особенно велики концентрации фенола в стоках коксохимичесих заводов - до 20 г/л, а современный коксохимический завод сбрасывает в сутки в водоемы до 4 - 10 т фенола.

Превышение естественного фона по фенолу может служить указанием на загрязнение водоемов. В загрязненных фенолами природных водах содержание их может достигать десятков и даже сотен микрограммов в 1 литре.

Вода водоема приобретает окраску, специфический запах карболки, покрывается флуоресцирующей пленкой, мешающей естественному течению биологических процессов в водоеме. При концентрациях 75 мг/л фенол тормозит процесс биологический очистки в водоеме, при концентрации 0,01 - 0,1 мг/л в мясе рыб появляется неприятный привкус; неприятный вкус и запах воды исчезают только при разбавлении фенола до концентрации 0,11 мг/л. В поверхностных водах фенолы могут находиться в растворенном состоянии в виде фенолятов, фенолят-ионов и свободных фенолов.

Фенолы в водах могут вступать в реакции конденсации и полимеризации, образуя сложные гумусоподобные и другие довольно устойчивые соединения. В условиях природных водоемов процессы адсорбции фенолов донными отложениями и взвесями играют незначительную роль. Фенол оказывает влияние на живые организмы не только своей токсичностью, но и значительным изменением режима биогенных элементов и растворенных газов (кислорода, углекислого газа).

Простые фенолы подвержены главным образом биохимическому окислению. При концентрации более 1 мг/л разрушение фенолов протекает достаточно быстро, убыль фенолов составляет 50-75% за трое суток, при концентрации в несколько десятков микрограммов в 1 литре этот процесс замедляется, и убыль за то же время составляет 10-15%. Быстрее всех разрушается собственно фенол, медленнее крезолы, еще медленнее ксиленолы. Многоатомные фенолы разрушаются в основном путем химического окисления. Наличие нефтяного загрязнения замедляет распад фенолов, так как биодеградация нефтяных углеводородов образует собственные фенолы, увеличивая общую картину загрязнений. Концентрация фенолов в поверхностных водах подвержена сезонным изменениям. В летний период содержание фенолов падает (с ростом температуры увеличивается скорость распада).

Экспериментальная часть

Приборы и оборудование:

Три стакана на 150 мл и 1 стакан на 400-500 мл.

Три штатива с пробирками.

Электронные весы.

Пипетки для отбора проб.

Четыре колбы на 500 мл.

Две измерительные пробирки.

Ступка с пестиком.

Приготовление растворов токсикантов.

В качестве токсикантов готовились растворы ацетата свинца Рb(СНзСОО)2, сульфата кадмия CdSO4 и фенола С6Н5ОН.

В начале готовились базовые растворы токсикантов с концентрацией 1 х 10 [-2] моль/л. Для этого взвешивались навески солей ацетата свинца массой 32,5 г, сульфата кадмия массой 20,8 г и 9,4 г фенола. Каждая помещалась в 100 мл колбу и растворялась в дистиллированной воде, которая добавлялась до метки.

Растворы меньшей концентрации готовили следующим образом. Из колбы с помощью пипетки отбирали 1 мл раствора концентрации соли1х10 [-2] моль/л помещали в пробирку и добавляли 9 мл воды. Таким образом получали растворы токсикантов с концентрацией в 10 раз меньшей предыдущей, т. е. 1 х 10 [-3] моль/л.

Используя этот приём, готовили ещё более разбавленные растворы ацетата свинца, сульфата кадмия и фенола 1х 10 [-3]; 1х10 [-4]; 1х10 [-5]; 1х10 [-6] моль/л.

Приготовление раствора мочевины.

Для приготовления 500 мл 1 % раствора 5 г мочевины растворили в 495 мл дистиллированной воды.

Приготовление экстракта уреазы.

Для исследования готовили два экстракта уреазы. Первый экстракт из семечек кабачка урожая 2010года, второй экстракт из оставшихся семян урожая 2009 года. 7-8 семечек очищались от кожуры, растирались в ступке и разводились 20 мл воды.

Полученные экстракты сливались в пробирки и использовались для опытов.

Опыт №1 <<Подтверждение активности уреазы кабачка и арбуза>>.

Поочередно брали по 2 мл Экстракта 1, Экстракта 2 добавляли к ним по 1 мл дистиллированной воды, 2 мл 1%-ного раствора мочевины и 2-3 капли спиртового раствора фенолфталеина смесь энергично встряхивали. И в течении 3-5 мин наблюдали за изменением окраски. Появление малиновой окраски (фото 1) в экстракте 1 , экстракте 2 подтверждает активность уреаз.

Уреаза катализирует разложение мочевины: уреаза

(NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2.

NH3 + HOH NH[4+] + OH[-]

Выделяющийся аммиак в водном растворе создаёт щёлочную среду, которая фиксируется по появлению малиновой окраске фенолфталеина.

Опыт№2 <<Определение активности уреаз по методу Вольгемута>>.

Метод основан на определении наименьшего количества уреазы (при максимальном разведении экстрактов), полностью расщепляющей всю добавленную мочевину.

В этом случае уреазная активность экстрактов выражается объемом (в мл) 1%-ного раствора мочевины, который подвергается гидролизу 1 мл неразведенной уреазы в течение3 5 минут.

В 10 пробирок наливаем по 1 мл дистиллированной воды и в первую из них добавляем 1 мл неразведённого экстракта уреазы 1. Перемешиваем содержимое этой пробирки и переносим 1 мл смеси во вторую пробирку. Содержимое второй пробирки также перемешиваем, переносим 1 мл смеси в 3 пробирку и продолжаем так делать до 10 пробирки. Из 10 пробирки выливаем 1 мл смеси.

Во все пробирки добавляем по 1 мл воды и по 2 мл 1%-ного раствора мочевины, перемешиваем содержимое, встряхиваем пробирки и добавляем 3-4 капли 0,1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и наблюдаем появление малиновой окраски в течение 5 мин. , и отмечаем номер пробирки, где окраска появляется, т. е. гидролиз проходит полностью.

Результаты заносим в таблицу № 1.

Таблица №1

№ пробирки

Разведение уреазы экстракт 1

1/ 10240

Цвет фенол- фталеина розовый розовый

Бледно розовый

Бледно розовый

Аналогичный опыт проделываем с экстрактом 2 и результаты заносим в таблицу № 2

Таблица №2

№ пробирки

Разведение уреазы экстракт 2

1/ 10240

Цвет фенол- фталеина розовый розовый

Бледно розовый

Рассчитываем активность уреазы экстракта 1

Составляем пропорцию: 1/160 мл расщепляет 2мл 1%-ного раствора мочевины, тогда

1 мл экстракта 1 расщепляет Х1 мл 1%-ного раствора мочевины, Х1 = 2 х 1 х 160 = 320 мл

Расчёт активности уреазы экстракта 2

1/80 - 2 Х2 =2 х 1 х 80 = 160 мл

Следовательно, 1 мл приготовленного экстракта 1 уреазы кабачка расщепляет за 5 мин 320 мл 1%-ного раствора мочевины, а экстракт 2 160 мл.

Опыт №3 <<Влияние катиона свинца Pb [+] на активность уреазы>>.

В пять отдельных пробирок помещаем по 2 мл экстракта 1 и экстракта 2 добавляем по 2 мл раствора ацетата свинца концентрацией 10-2 моль/л, 10[-3] моль/л, 10[-4] моль/л, 10[-5] моль/л, 10[-6] моль/л, встряхиваем и добавляем 2 мл 1 % раствора мочевины, 2-3 капли 0,1% спиртового раствора фенолфталеина. Наблюдаем за изменением окраски фенолфталеина в течение 5 мин. Результаты заносим в таблицы 3,4.

Таблица №3 экстракт 1

С (Pb(CH3COO)2) моль/литр

10 [- 2]

10 [-3]

Цвет фенолфталиина

- малиновый малиновый малиновый малиновый

Таблица №4 экстракт2

С (Pb(CH3COO)2) моль/литр

10 [- 2]

10 [-3]

Цвет фенолфталиина

- малиновый малиновый малиновый малиновый

Опыт №4 <<Влияние катиона кадмия Cd[2+] на активность уреазы кабачка>>.

2 мл экстракта 1 и 2 мл экстракта 2 помещаем соответственно в 5 пробирок, добавить в каждую пробирку по 2 мл раствора сульфата кадмия по убыванию концентрации токсиканта 10-2 моль/л, 10[-3] моль/л, 10[-4] моль/л, 10[-5] моль/л, 10[-6] моль/л, по 2 мл 1% раствора мочевины, встряхиваем и добавляем 3 - 4 капли 0,1 % спиртового раствора фенолфталеина и следим в течение 5 мин за изменением окраски смеси (фото 2,3).

Наблюдения заносим в таблицы 5,6.

Таблица №5 экстракт 1

С (СdSO4) моль/литр

10 [-2]

10 [-3]

10 [-4]

10 [-5]

10 [-6]

Цвет фенолфталиина нет нет

Бледно розовый

Бледно розовый

Розовый

Таблица №6 экстракт 2

С (СdSO4) моль/литр

10 [-2]

10 [-3]

10 [-4]

10 [-5]

10 [-6]

Цвет фенолфталиина нет нет нет

Бледно розовый

Розовый

Мы наблюдаем изменение окраски растворов в течение 5 минут, отмечаем ее интенсивность, сравнивая с окраской соответствующего экстракта, но где отсутствует токсикант. Опыт показал, что активность экстракта 1 и экстракта 2 подавляется при концентрации сульфата кадмия 0,001 моль /л.

Опыт №5 <<Влияние фенола С6Н5ОН на активность уреазы кабачка>>.

По 2 мл экстракта 1 и экстракта 2 помещаем соответственно в 5 отдельных пробирок, добавляем по 2 мл раствора фенола различной концентрации 10-2 моль/л, 10[-3] моль/л, 10[-4] моль/л, 10[-5] моль/л, 10[-6] моль/л, интенсивно встряхиваем, добавляем 2 мл 1% раствора мочевины и 3-4 капли 0,1% спиртового раствора фенолфталеина. Отмечаем изменение окраски растворов в течение 5 мин. Данные заносим в таблицы 7,8.

Таблица № 7 экстракт 1

С (С6Н5OН) моль/литр

10 [-2]

10 [-3]

10 [-4]

10 [-5]

10 [-6]

Цвет фенолфталиина нет нет

Бледно розовый

Розовый

Розовый

Таблица № 8 экстракт 2

С (С6Н5OН) моль/литр

10 [-2]

10 [-3]

10 [-4]

10 [-5]

10 [-6]

Цвет фенолфталиина нет нет нет

Бледно розовый

Бледно розовый

При концентрации раствора фенола 0,0001 моль/л активность уреазы экстрактов 1 и 2 подавляется.

Выводы:

1. Проведенные исследования показали, что активность уреазы семян кабачка со временем уменьшается. Активность экстракта №1 (семена 2010 года) - 320 единиц; активность экстракта №2 (семена 2009 года) - 160 единиц.

2. Особенно чувствительна уреаза обоих экстрактов к действию фенольных растворов. Оба экстракта теряют активность при концентрации фенола 10-4 моль/л, и сохраняется при концентрации 10-5 моль/л (0,00094 г/л), что превышает ПДК фенола в воде в 10 раз.

3. Активность экстрактов №1 и №2 сохраняется при концентрации сульфата кадмия 0,001 моль/л (0,0208 мг/л), что в 2 раза больше ПДК для питьевой воды, но в 20 раз меньше чем ПДК для сточных вод (0,1 мг/м[3]).

4. Оба экстракта теряют свою активность при действии раствора ацетата свинца 10[-3] моль/л (0,0325 мг/м[3]), что в 30 раз меньше чем ПДК свинца для воды (0,1мг/м[3]).

5. Проведенные опыты подтвердили, что уреаза может использоваться как биосенсор для обнаружения экологических токсикантов в водной среде, особенно таких активных загрязнителей, как свинец, кадмий, фенол.

6. В нашем эксперименте биоиндикаторные способности экстракта№1 и экстракта№2 оказались одинаковыми. Различия в активности уреаз не повлияли на ее биосенсорные свойства.

7. Уреаза может использоваться для обнаружения тяжелых металлов, для оценки общего загрязнения воды ионами тяжелых металлов.